肝再生增强因子干预肾小管上皮细胞凋亡的作用机制探讨

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1、重庆医科大学硕士研究生学位论文rrALR干预肾小管上皮细胞凋亡作用机制探讨摘要目的；观察肝再生增强因子(Augumenterofliverregeneration，ALR)在体外对庆大霉素诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法：NRK-52E细胞用含5％胎牛血清的DMEM培养液培养于370C、5％C02恒温培养箱。将细胞分为(1)正常对照组O田：用无血清DMEM培养液培养；(2)庆大霉素(Gentamicinsulfate。GM)损伤组，在培养液中加

2、入终浓度为1．6mg／ml的GM；(3)舭R干预组：根据给予AIR的不同剂量分为G卜A1组和G+A2组两个亚组。G+A1组：在培养液中加入终浓度为1．6mg／ml的GM，同时加入终浓度15ug／ml的ALR；G+A2组：在培养液中加入终浓度为1．6mg／ml的GM，同时加入终浓度25ug／ml的ALR。分别培养细胞24h，48h。采用吖啶橙／溴乙啶(A帆B)染色、DNA琼脂糖凝胶电泳及AnnexmV／PI双染流式细胞仪检测，从形态学、定性和定量检测上述各组细胞凋亡状况。用Western-blot

3、和RT-PCR检测不同时间点各组细胞Bcl-2和Bax蛋白和mRNA表达情况。采用WesternBlot检测各组中磷酸化的Akt及总的Akt表达水平以及P13K的表达。结果：1、荧光显微镜下观察经A0／】狙染色的各组细胞，正常对照组在重庆医科大学硬士研究生学位论文24小时大多数细胞核染色质呈绿色，仅见少数核呈亮绿色或橘红色，呈固缩状的凋亡细胞；到48小时凋亡细胞数略有增加。GM损伤组作用24小时后，可见较多的核着亮绿色或橘红色、呈固缩状或片段状的凋亡细胞，当时间延长到48小时，凋亡细胞进一步增多

4、。根据细胞形态和染色状况，随机选取视野计数各组细胞的凋亡情况，结果显示：不同浓度ALR干预组(15ug／ml或25ug／m1)作用24h及48h，N_rRI<一57E细胞凋亡率均较未予ALR干预的GM处理组明显减少(均P<0。05)，而浓度较高的ALR干预组(25ug／m1)作用更为明显。2、DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在24小时，GM处理组细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳未见到凋亡典型的梯形条带。在48h，正常对照组仍未见梯形条带。GM组和ALR干预组(15ug／ml或25ug／m1)均呈现出

5、由不同大小的DNA片段组成的数条特征性凋亡梯形条带，大小为180-200bp的不同倍数。根据48小时各组条带的灰度值X面积分析，不同浓度ALR干预组(15ug／ml或25ug／m1)均较未予ALR干预的GM处理组的片段化程度明显减轻(p<0．05)，而浓度较高的ALR干预组(25ug／m1)作用更为明显。3、AnnexinV／PI双染的流式细胞仪显示，正常组细胞在24h有极少量细胞发生凋亡，凋亡率1．04％；而GM损伤组为6．78％；ALR干预．组(15ug／ml或25ug／m1)细胞的凋亡率分

6、别为5．40％和3．53％，与GM损伤组比较有所下降(P

7、cl一2、Bax蛋白表达量显著增加(P

8、Bcl一2／Bax比值显著增加(P<0．05)，在多个不同时间点(1小时，2小时，24小时，48小时)检测到总Akt蛋白的表达，各个时间点总Ala变化无显著性(p>0．05)，GM与越R干预组之间总Akt表达量无差别(p>o．05)。未发现磷酸化Akt及P13K的表达和变化。结论：1、ALR对庆大霉素诱导的NRK-52E细胞凋亡具有抑制作用，表明ALR可能通过抑制肾小管上皮细胞凋亡而减轻肾毒性药物对小管上皮细胞的损伤。2、目前对细胞凋亡的调控机制尚未阐明，但已知Bcl．2基因家族在细胞凋亡中起了