甜荞fedreb1基因及其启动子的功能分析

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1、分类号：S326学校代码：10712UDC：631.5研究生学号：2010060029密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文甜荞FeDREB1基因及其启动子的功能分析学科专业：植物资源学研究方向：植物资源与利用研究生方正武指导教师：冯佰利教授完成时间：2015年3月中国陕西杨凌Classificationcode:S326Universitycode:10712UDC:631.5Postgraduatenumber:2010060029Confidentialitylevel:PublicDissertationf

2、orDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin_2015_ISOLATIONANDFUNCTIONALANALYSISOFFEDREB1ANDITSPROMOTERINBUCKWHEAT(FAGOPYRUMESCULENTUM)Major:PlantResourseScienceResearchfield:PlantResoursesandUtilizationNameofPostgraduate:FangZhengwuAdviser:ProfessorFengBailiDateofsubmissio

3、n:March,2015YanglingShaanxiChina资助项目国家自然科学基金项目（31071472）农业部公益性行业（农业）科研专项（200903007)农业部公益性行业（农业）科研专项（201303008）陕西省科技攻关（2012K01-09）陕西省小杂粮产业技术体系甜荞FeDREB1基因及其启动子的功能分析摘要荞麦为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(FagopyrumMill)的非禾谷类粮食作物，主要栽培种有苦荞(F.tartaricumGaerth)和甜荞(F.esculentumMoench)。

4、荞麦因其生育期短、抗旱性强和对环境适应性好等优点，成为我国西北和西部干旱、半干旱高海拔冷凉山地重要的粮食作物。因其种子富含赖氨酸、芦丁和抗氧化活性等物质，具有很高的营养与保健功效，市场前景广阔。开展对荞麦抗逆分子生物学研究，不仅有助于解析荞麦对环境协迫应答的分子机制，同时为高产、耐逆与适应性好的荞麦新品种选育与种质创新积累基因资源。本研究以耐旱性较强的甜荞品种‘西农9976’为试验材料，从DREB同源基因及其启动子的分离与功能鉴定入手，研究该基因参与调控甜荞抗旱与耐寒应答模式与生理功能，探讨该基因参与甜荞抗逆应答的分子机制。主要研

5、究结果如下：(1)同源克隆结合RACE技术，从甜荞品种‘西农9976’中分离出1个DREB同源基因，命名为FeDREB1。该基因序列全长为859bp，编码1个由189个氨基酸残基组成的转录因子。序列分析表明，FeDREB1蛋白具有植物DREB(A-1)亚家族转录因子特点，包括1个AP2/EREBP结构域、1个DSAWR基序、1个LWSY基序和核定位信号。酵母单杂技术分析显示，甜荞FeDREB1蛋白与DRE/CRT顺式作用元件特异结合，并激活下游目标基因的表达。亚细胞定位研究结果表明，转化pBI221-FeDREB1-GFP重组表达

6、载体的洋葱表皮细胞中只有细胞核存在明显的GFP荧光信号，其它细胞部分没有荧光信号，表明FeDREB1转录因子定位于细胞核中。这些结果充分证实FeDREB1蛋白属于DREB(A-1)亚家族转录因子。(2)构建pBI121-FeDREB1表达载体，经农杆菌GV3101介导，采用浸花法转化拟南芥(Arabidopsisthaliana)，通过PCR和实时荧光定量方法进行了分子检测，获得35S::FeDREB1稳定表达的T3代转基因植株和含有pBI121空载体的T3代野生型。对T3代35S::FeDREB1转基因拟南芥植株进行表型、抗冻性

7、和抗旱性分析表明，35S::FeDREB1的拟南芥植株出现了矮化和延迟开花性状，其抗旱性和抗冻性均得到明显的提高；喷施外源赤霉素GA3可以使拟南芥35S::FeDREB1的株高和开花时间恢复为野生型，但其抗冻性依然显著高于野生型拟南芥；生理指标测定表明35S::FeDREB1转基因拟南芥植株叶片的脯氨酸、可溶性糖含量明显高于野生型；在正常生长条件下，35S::FeDREB1转基因拟南芥植株的相对电导率与野生型没有差异，而在冻害和干旱胁迫下，35S::FeDREB1转基因拟南芥植株的相对电导率显著低于野生型。(3)种子萌发试验表明，

8、拟南芥35S::FeDREB1植株种子对外源ABA高度敏感。利用数字基因表达谱技术(DGE)比较了拟南芥35S::FeDREB1植株与野生型植株叶片的基因差异表达情况，结果发现在35S::FeDREB1拟南芥的ERD7、ERD10、COR47、CO