甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制

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1、本研究由以下项目资助国家高技术研究发展计划(863计划)(No.2011AA10A210)TheResearchwasSupportedbyNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgram863ofChina(No.2011AA10A210)甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制PreparationofMannosereceptor-mediatedPseudomonasaeruginosarecombinantantigenv

2、accinesanditsimmunemolecularmechanism作者姓名：崔子寅专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学指导教师：韩文瑜教授学位类别：农学博士培养单位：动物医学学院论文答辩日期：2015年6月6日授予学位日期：年月日论文评阅人答辩委员会组成姓名职称工作单位姓名职称工作单位周锐教授华中农业大学主席王笑梅研究员中国农业科学院佘锐萍教授中国农业大学委员涂长春研究员军事医学科学院周恩民教授西北农林科技大学钱爱东教授吉林农业大学姚火春教授南京农业大学王春凤教授吉林农业大学陈金顶教授华南

3、农业大学丁壮教授吉林大学欧阳红生教授吉林大学张乃生教授吉林大学中文摘要甘露糖受体介导的多糖重组抗原铜绿假单胞菌疫苗的研制及其免疫分子机制随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，为避免传统灭活苗接种剂量较大，产生免疫力较慢，弱毒苗毒力返强的缺点，针对不同疾病已开展了各种新型基因工程疫苗的研制。但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生有效免疫应答等不足，从而需要某种载体或佐剂来弥补这种不足。传统载体或佐剂又存在许多缺陷，如引起局部炎症反应、致癌、不易在体内[183]降解等，所以需要研发新型载

4、体或佐剂来克服上述缺点。壳聚糖，是来自甲壳素的天然高分子多糖，在体内其能被溶菌酶生物降解。具有黏膜粘附的特点，是一种黏膜吸收增强剂，己被用作黏膜给药的载体。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功[186]能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、成囊、成膜和无毒性。在美[187]国PLGA已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。甘露糖是目前唯一用于在临床上的糖质营养素，其可直接被利用合成糖蛋白，参与免疫细胞上甘露糖受体介导的内吞等免疫调节作用，进一步激活T淋

5、巴细胞，提高MHC-I和MHC-II分子的抗原递呈。因此运用壳聚糖、PLGA和甘露糖这三种可生物降解材料作为新型的疫苗载体或佐剂具有巨大的潜力。本研究采用分子生物学技术，从铜绿假单胞菌标准株ATCC27853和铜绿假单胞菌水貂分离株DL9基因组中获得外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83的基因，并通过融合PCR的方法将其融合在一起。利用DNAStar、DNAMAN和多个生物学网站对其进行生物信息学分析。OprF190-342-OprI21-83基因的核苷酸序列在铜绿假单胞菌不同菌株间高度保守；蛋白成

6、亲水性，二级结构主要以α螺旋为主。随后综合多种有利于直接表达具有活性重组蛋白的条件，在大肠杆菌表达系统中成功可溶性表达铜绿假单胞菌标准株ATCC27853的外膜蛋白OprF190-342-OprI21-83（FI），利用凝血酶去除其载体上的GST标签，实现无标签蛋白FI的可溶性表达。巨噬细胞和树突细胞等免疫细胞表面都具有丰富甘露糖受体（MMR）的表达，用甘露糖修饰载体，则能通过受体介导的吞噬作用，来提高细胞对于药物的I摄取。因此，本研究以甘露糖和壳聚糖为材料，在氰基硼氢化钠的催化下，使甘露糖的羧基与壳聚糖的氨基

7、发生缩合反应，将甘露糖修饰到壳聚糖上，获得甘露糖修饰的壳聚糖衍生物。以已获得的铜绿假单胞菌外膜融合蛋白FI为模式抗原，采用离子凝聚法和复乳法成功制备了含有抗原FI的壳聚糖微球载体疫苗（FI-CS-MPs）、甘露糖修饰的壳聚糖微球载体疫苗（FI-MCS-MPs）、壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-CP-MPs）和甘露糖修饰的壳聚糖包衣的PLGA微球载体疫苗（FI-MCP-MPs）。并通过扫描电镜、粒径测定仪、BCA蛋白浓度测定等方法对这四种生物可降解多糖微球载体疫苗的表征进行了检测。结果显示四种微球疫苗均成

8、正球体，形态规则，分散性良好，表面不光滑成粗糙状态，无褶皱；平均粒径大小都在2~3μm；包封率与载药量良好；在体外抗原释放实验中，可降解多糖微球载体疫苗在最初的12小时内释放出约30%~50%的抗原FI，并且经过甘露糖修饰的微球载体疫苗的释放率始终高于未经甘露糖修饰的微球载体疫苗。以获得的四种可降解多糖微球载体疫苗为基础，将模式抗原FI标记上FITC荧光，通过流式细胞术和激光共聚焦两种