液氦玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞的研究

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文液氦玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞的研究Studyonliquidheliumvitrificationofbovineimmatureoocytes学位申请人：许亚坤×××指导教师：禹学礼教授、李晓霞博士博士一级学科：畜牧学二级学科：动物遗传育种与繁殖学位类别：农学硕士2015年06月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证

2、书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要哺乳动物卵母细胞的冷冻保存是生命科学领域的重要研究内容之一，近年来，尽管人们对此进行了大量的研究，但卵母细胞冷冻保存的效果仍不理想，尤其是未成熟卵母细胞的冷冻效果更差。影响卵母细胞玻璃化冷冻效果的因素很多，其中降温速率被认为是最重要的影响因素。目前，卵母细胞玻璃化冷冻主要采用液氮(-196℃)为冷源，而液氦的温度可以达到-269℃，本课题拟在液氮OPS玻璃化冷冻的基础上，尝试以温度更低的液氦为冷源，通过加快降温速

3、率来改进牛未成熟卵母细胞的冷冻效果，建立并优化牛未成熟卵母细胞的液氦玻璃化冷冻方法。1.牛未成熟卵母细胞液氮OPS玻璃化冷冻方法的建立试验1：OPS管拉制方法研究。分别以水浴锅、普通酒精灯和自制小酒精灯为热源，探究OPS管的拉制方法。结果表明，水浴锅和普通酒精灯均无法拉制出符合要求的OPS管，只有自制小酒精灯可以拉制出内径和管壁厚度分别为0.8mm和0.07mm左右的OPS管。试验2：细管法和OPS玻璃化冷冻法的对比。将采集到的COCs随机分为3组，对照组、细管组和OPS组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。两个冷

4、冻组分别用细管法和OPS法进行玻璃化冷冻，解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示：与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、86.1%、69.7%和38.2%)相比，两冷冻组的各项指标均显著降低(P＜0.05)。在两个冷冻组中，细管组和OPS组卵母细胞的形态正常率分别为65.2%和77.8%，成熟率分别为31.0%和41.6%，卵裂率分别为19.9%和29.8%，囊胚率分别为0和7.0%。OPS组上述指标均明显高于细管组(P＜0.05)。结论：用自制小酒精灯更易于拉制出适于玻璃化冷冻的OPS管；液

5、氮OPS法玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞的效果优于细管法。2.牛未成熟卵母细胞液氦OPS玻璃化冷冻方法的探索将采集到的COCs随机分为3组，对照组、液氮组和液氦组。对照组不经冷冻直接进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。两个冷冻组分别以液氮和液氦为冷源，以OPS管为载体对牛未成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻，解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示：与对照组卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、87.0%、69.5%和42.0%)相比，两冷冻组的各项指标I摘要均显著降低(P＜0.05)。在两个冷冻组中，液氦组解冻后

6、卵母细胞的形态正常率(84.7%)显著高于液氮组(78.5%；P＜0.05)。经过体外成熟后，液氦组卵母细胞的成熟率(43.9%)显著高于液氮组(39.2%；P＜0.05)。经过体外受精和早期胚胎体外培养后，液氦组的卵裂率和囊胚率(35.4%和6.4%)显著高于液氮组(30.0%和4.1%；P＜0.05)。结论：液氦OPS玻璃化冷冻法的效果优于液氮法；液氦作为冷源冷冻保存牛未成熟卵母细胞是可行的。3.液氦OPS玻璃化冷冻方法的优化试验试验1：最佳冷冻保护液的筛选。将采集到的COCs随机分为6组，其中一组不经冷冻，作为对照组，其余五组分

7、别使用五种浓度的冷冻保护液(EDS30、EDS35、EDS40、EDS45和EDS50)进行液氦OPS法玻璃化冷冻，解冻后分别进行IVM、IVF和早期胚胎IVC。结果显示：与对照卵母细胞的形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率(100%、84.5%、69.9%和41.1%)相比，所有冷冻组的各项指标均显著降低(P＜0.05)。在五个冷冻组中，EDS35组卵母细胞(90.3%、51.9%、41.8%和10.0%)冷冻-解冻后的冷冻效果均显著高于其他四组(P＜0.05)。EDS50组(75.1%、36.0%、27.2%和2.6%)的冷冻效果最

8、差，显著低于其他四组(P＜0.05)。EDS30(83.0%、42.0%、33.8%和6.5%)、EDS40(84.9%、43.9%、34.9%和6.4%)、EDS45(82.6%、42.4%、33.2%和5.1%)组之