禽传染性支气管炎病毒非编码RNA的形成机制及其生物学功能

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1、学号：201573029密级：博士研究生学位论文禽传染性支气管炎病毒非编码RNA的形成机制及其生物学功能专业：作物保护学研究方向：分子病毒学研究生：安红柳指导教师：方守国教授论文起止日期：2015年9月至2018年4月学号：201573029密级：博士研究生学位论文禽传染性支气管炎病毒非编码RNA的形成机制及其生物学功能专业：作物保护学研究生：安红柳指导教师：方守国教授论文起止日期：2015年9月至2018年4月GenerationMechanismandBiologicalFunctionofaNoncodingRNAProducedbyAvianInfecti

2、ousBronchitisVirusMajor：CropProtectionGraduateStudent：HongliuAnSupervisor：Prof.ShouguoFangSchoolofAgriculture,YangtzeUniversitySeptember,2015toApril,2018摘要许多病毒利用不同的机制产生非编码RNA（noncodingRNA，ncRNA），主要包括由RNA聚合酶II或III转录而成的ncRNA和通过细胞5’-3’核酸外切酶不完全降解产生的亚基因组ncRNA。这些ncRNA在病毒的生活周期和病毒-宿主互作中发挥着非常重

3、要的作用，包括自动调控病毒基因的表达、改变细胞周期、以及逃避宿主的防卫反应等。至今，大多已发现的病毒ncRNA是由DNA病毒所编码的，除黄病毒属病毒和少数植物病毒外，由RNA病毒产生的ncRNA鲜有报道，目前尚未有关冠状病毒编码ncRNA的报道。禽传染性支气管炎病毒（Infectiousbronchitisvirus,IBV）属于冠状病毒科（Coronaviridae），Gamma冠状病毒属的成员，是一种具囊膜的单股正链RNA病毒。在感染细胞中，IBV通过由基因组5’-端的转录调控序列（TRS）中和编码结构蛋白和辅助蛋白基因前的保守核心序列CU(U/G)AACAA

4、介导的、以非连续转录机制合成5条亚基因组RNA（sgRNA），编码病毒的结构蛋白和辅助蛋白。在本研究中，我们首次发现并鉴定了由IBV产生的一条ncRNA；利用反向遗传学技术获得病毒突变体，揭示了该ncRNA的形成机制，定位了影响ncRNA形成的关键核苷酸；通过分子生物学技术和转录学分析对该ncRNA的生物学功能进行了初步研究。结果如下：1、在IBV感染的Vero细胞和鸡胚中，通过RT-PCR检测，发现IBV能产生一条小的新sgRNA。克隆后测序，序列分析结果显示，该sgRNA全长563nt（不包括poly（A）尾），由IBV基因组长63nt的5’-端前导序列和3’

5、-UTR（27104-27608nt）组成。由于其不含起始密码子AUG，故为一ncRNA。2、为了揭示ncRNA的形成机制，定位影响ncRNA形成的关键核苷酸，我们以IBV-p65为遗传背景，利用已建立的IBV反向遗传学体系，构建并获得了一系列重组病毒，并对其生物学特性进行了分析，结果如下：（1）将EGFP的ORF插入IBV基因组3’-UTR27149-27150nt间，获得的重组病毒感染细胞后，可检测到EGFP的表达，证实该ncRNA是一条mRNA。（2）通过缺失、点突变，构建并获得重组病毒IBV-U27104A、IBV-A27105U、IBV-A27106U、

6、IBV-C27107G、IBV-A27108U、IBV-Δ27104-08和IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C。RT-PCR检测这些病毒感染细胞中的ncRNA。结果显示，点突变U27104A和A27108U对ncRNA的合成无显著影响，点突变A27105U和A27106U导致ncRNA的合成显著减少，而点突变C27107G和Δ27104-08完全阻碍了正链和负链ncRNA的合成。结果说明，至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需。此外，位于非标准核心I序列（27104UAACA271

7、08）下游的A27110/A27111/G27113/G27114与前导序列中核心序列下游序列保守。当用含有4个点突变的重组病毒IBV-A27110U/A27111U/G27113C/G27114C感染细胞后，在感染细胞中未能检测到ncRNA的合成，显示这4个核苷酸对ncRNA合成也至关重要。综上所述，该ncRNA是由非标准核心序列27104UAACA27108介导的、通过非连续转录机制转录而产生的，至少3个核苷酸（A27105/A27106/C27107）为ncRNA的有效合成所必需，且位于非标准核心序列（27104UAACA27108）下游的A27110/A2

8、7111/