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1、分类号：R373密级：公开学校代码：11065学号：2015020059学术博士学位论文EB病毒非编码RNA参与干扰素功能抑制的研究作者姓名赵真真指导教师罗兵教授专业领域病原生物学培养单位医学部基础医学院答辩日期2018年5月13日EB病毒非编码RNA参与干扰素功能抑制的研究摘要疱疹病毒可表达多种不同长度和结构的非编码RNA，其中EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转录表达两种被称为EBERs(EBV-encodedRNAs)的小RNA和几种微小RNA(microRNAs,miRNAs)，EBER
2、s是在所有EBV相关疾病及潜伏感染细胞中表达最为丰富的转录本。体外几乎所有EBV感染细胞中都能检测到EBERs的转录表达，因此在临床样本中通常被用作检测EBV感染的金标准。EBERs在体内及体外细胞培养中均可对细胞生长及其生理功能产生广泛影响，尽管大量EBERs在EBV感染潜伏期表达并具有重要功能，但其体内生物学功能及其作用的分子机制并未被阐明。目前数据库中两份EBER相关高通量测序结果显示，EBER过表达前后共有2000条左右差异表达基因，功能注释分类表明这些基因涉及多种细胞生物学功能和信号传导通路，其中多个信号
3、通路与肿瘤相关。但两份报告差异表达基因种类和差异倍数不尽相同，且仅在淋巴瘤中进行了检测，尚未见上皮细胞中EBER基因作用的高通量检测分析相关研究报道。Ⅰ型干扰素(interferons,IFN)是宿主免疫对抗肿瘤的关键成分，Ⅰ型干扰素对治疗癌症过程中的免疫反应起着关键作用。尽管数据显示EBER与干扰素相关基因有关，但具体生物学机制仍未被阐明。目的：①建立成功敲除EBERs基因的EBV阳性鼻咽癌细胞系C666-1和EBER1基因过表达的SGC7901细胞系。②细胞学实验检测EBER敲除及过表达前后细胞迁移、增殖及凋亡
4、等细胞生物学行为改变。③高通量测序分析筛选出C666-1细胞系EBER基因敲除或SGC7901细胞系过表达前后差异表达基因以及SNP和缺失位点。④通过对差异表达基因的富集分析，筛选出EBER相关的分子通路以及靶点。⑤对部分差异表达基因进行验证和比较分析，深入研究EBER可能的作用机制，为阐明EBER表达在EBV相关肿瘤中致病机制提供实验基础和理论依据。方法：①CRISPR/Cas9双载体慢病毒转染鼻咽癌细胞系C666-1，EBER1过表达pcDNA3.1-EGFP质粒载体转染胃癌细胞系SGC-7901，使用流式细胞
5、术分选携带荧光的细胞，并采用有限稀释法筛选获得单克隆目的细胞系。②对上述细胞系及其对照细胞系进行生物学表型检测，采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力，CCK8实验检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡情况。③采用高通量转录组测序技术对上述细胞系及其对照细胞系进行转录组测序，生物信息学技术对测序数据进行分析，包括测序数据的预处理、基因组比对、SNP分析、差异表达基因分析、差异基因mRNAGO(GeneOntology)富集分析、差异基因mRNAIKEGG(KyotoEncyclopediao
6、fGenesandGenomes)富集分析以及EBV表达基因分析。④提取EBV阴性肿瘤细胞系(SGC7901,BGC823,HGC27,AGS,CNE,HONE)、EBV阳性肿瘤细胞系(GT38,GT39,SNU719,C666-1)以及EBER基因成功敲除及过表达细胞系和对照细胞系总RNA和总蛋白，采用实时荧光定量PCR(Quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)对转录组测序筛选出的部分表达差异基因(ADAR,CASP11,PML,IFR3,IFR7,IFR9,PKR,ISG60,ISG1
7、5,PRKRA,MX1,2’5OAS)的转录表达进行验证。⑤选取一条富集分析筛选出差异表达基因分布较集中的通路，即干扰素相关分子通路进行深入研究，采用实时荧光定量PCR检测该通路关键调节分子IKKε和PIAS1基因转录表达，WesternBlot检测分析STAT1,IRF9蛋白表达水平，WesternBlot和免疫荧光法相结合分析STAT1蛋白磷酸化状态。⑥采用IFN-α分别作用于EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901,BGC823,HGC27，AGS)，EBV阳性细胞系(GT38,GT39,SNU719)，EBER
8、基因敲除或过表达细胞系及其对照细胞系，并提取细胞总RNA；采用实时荧光定量PCR检测IFN-α处理后细胞系差异表达基因(ADAR,CASP11,PML,IFR3,IFR7,IFR9,PKR,ISG60,ISG15,PRKRA,MX1,2’5OAS)以及干扰素相关分子通路调节分子(IKKε，PIAS1)的表达水平。⑦采用CCK8实验检测IFN-α作用后的EBE
