氧化石墨烯对小鼠皮肤创面愈合的影响及初步机制研究

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分类号R644密级公开学号2002015114学校代码91012硕士学位论文氧化石墨烯对小鼠皮肤创面愈合的影响及初步机制研究杨涛指导教师罗高兴教授导师组成员吴军教授、贺伟峰研究员、夏和生教授培养单位陆三军医大学第一附属医院烧伤研究所申请学位类别硕士学术学位专业名称外科学（烧伤）论文提交日期2018年4月论文答辩日期2018年5月答辩委员会主席郭光华教授评阅人王小磊教授、王广庆教授二〇一八年五月 目录缩略语表..............................................................................................................................1英文摘要..............................................................................................................................3中文摘要..............................................................................................................................8论文正文氧化石墨烯对小鼠皮肤创面愈合的影响及初步机制研究..........................12第一章前言.....................................................................................................12第二章氧化石墨烯对创面愈合的影响.................................................................152.1研究背景......................................................................................................152.2材料与方法..................................................................................................152.3实验结果......................................................................................................212.4讨论......................................................................................................23第三章氧化石墨烯促进创面愈合的初步机制研究..............................................253.1研究背景......................................................................................................253.2材料与方法..................................................................................................253.3实验结果......................................................................................................343.4讨论......................................................................................................39全文结论....................................................................................................................44参考文献....................................................................................................................46文献综述氧化石墨烯生物医学应用的研究进展.........................................................53参考文献....................................................................................................................58攻读学位期间的研究成果.................................................................................................61致谢............................................................................................................................62 陆军军医大学硕士学位论文缩略语表英文缩写英文全称中文名称GOGrapheneOxide氧化石墨烯TPUThermoplasticPolyurethanes热塑性聚氨酯弹性体DMFN,N-DimethylformamideN,N-二甲基间酰胺RHRelativeHumidity相对湿度SPFSpecificPathogenFree无特定病原体PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液H&EHematoxylin-Eosin苏木素-伊红PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液RpmRevolutionperMinute转/分BSABovineSerumAlbumin牛血清白蛋白ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式培养物集存库CCK-8CellCountingKit-8细胞计数试剂盒-8ODOpticalDensity光密度FDAFoodandDrugAdministration美国食品药品监督管理局SEMScanningElectronMicroscope扫描电子显微镜TEMTransmissionElectronMicroscope透射电子显微镜AFMAtomicForceMicroscope原子力显微镜CLSMConfocalLaserScanningMicroscope激光共聚焦扫描显微镜DAPI4',6-Diamidino-2-Phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化酶IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIgEImmunoglobulinE免疫球蛋白EAPAmmoniumPersulfate过硫酸铵SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBSTrisbuffersolutionTris-HCl缓冲盐溶液’’TEMEDN,N,N,N-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺1 陆军军医大学硕士学位论文Tween-20PolyethyleneGlycolSorbitanMonolaurate吐温-20PVDFPolyvinylideneFluoridePVDF膜PCNAProliferatingCellNuclearAntigen增殖细胞核抗原GAPDHGlyceraldehyde-3-phosphateDehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶WBWesternBlot免疫印迹2 陆军军医大学硕士学位论文ThestudyofGOpromotingthewoundhealinginmiceanditspreliminarymechanismsinvitroAbstractBackground:Asthelargestorganofthehumanbody,theskinisanaturalbarrierbetweentheorganismandtheexternalenvironment.Itprotectsthebodyfromexternalphysical,mechanicalandchemicalstimuliandpathogenicmicroorganisminvasion;preventsthelossofwater,electrolytes,andvariousnutrientsfromthebody;perceivestheexternalenvironmentandcausescorrespondingnervereflexes,enablingpeopletoavoidharm.Furthermore,theskin'sstratumcorneum,sebaceousglands,etc.haveabsorptionfunction.Moreover,theskincansecretesweatandsebum,servingasanimportantpartofthebody'sthermoregulatorysystemandalsoapsychologicalandimmuneorgan.Therefore,skinplaysanirreplaceableroleinmaintaininghumanphysicalandmentalhealth.However,withthecontinuousdevelopmentofsociety,skininjuryhasgraduallybecomeoneofthemostcommonclinicalconverns.Variousfactorsandillnesses,suchasaccidents,trafficinjuries,diabeticulcers,andvascularlesions,canmoreorlesscauseacuteorchronicwounds,sequentiallyaffectingindividualhealthanddailylife.Skinwoundhealingisaccomplishedunderthesynergisticactionofavarietyoftissuecellsandnon-cellularcomponents,andreliesonanextremelycomplexpathophysiologicalprocesswithvariouspreciseregulations.Re-epithelializationisthebasicprocessofwoundrepair,andplaysacrucialroleinthereconstructionoftheintegrityofthemechanicalbarrieroftheskin.Theprocessofproliferatingepidermalcellsandmigratingfromedgesofwoundstothecenterisakeystepintheabove-mentionedevents,andhasbecomearesearchhotspotinthefieldofwoundhealing.2Grapheneisahexagonaltwo-dimensionalhoneycomblatticesheetcomposedofsphybridizedcarbonatoms,andhashighthermalconductivity,mechanicalstrength,electronmobility,andspecificsurfacearea,lowdensity,lowresistanceandotherphysicalproperties,3 陆军军医大学硕士学位论文whichmakeitagreatapplicationprospectinoptics,mechanics,electronics,aerospaceandotherfields.Grapheneoxide,oneofthemostimportantderivativesofgraphene,possesseslargenumberofhydroxylgroups,carboxylgroups,carbonylgroups,andepoxygroupsonthesurface,whichmakeitmorebiocompatible,aqueousstableandeasierfunctionalizedthangraphene.,andmakeitwidelyusedinbiomedicalresearch.However,thereisnorelevantliteraturesreportonwhethergrapheneoxidecanregulatethemigrationofepidermalcells.Epidermalcellmigrationisthedirectionalmovementofcellsandisanactiveenergy-consumingprocessrequiringtheinvolvementofcytoskeleton,especiallymicrofilamentskeletoncomposedofactin.Therefore,thesynergisticregulationofdepolymerizationandrearrangementofactinplaysanimportantroleinmaintainingcellmorphologicalchangesandcellmigration,therebyaffectingthewoundrepair.Inthisview,itisnecessarytostudytheeffectofgraphenoxideonwoundhealinganditsmechanism.Inthisstudy,wefirstlyobservedandevaluatedtheeffectofgrapheneoxideonthewoundhealinginafull-thicknessrskindefectmodelinmice.ThenHaCaTcells,ahumanimmortalizedepidermalcellline,wereselectedtoexplorethepotentialeffectsandpossiblemechanismsofgrapheneoxideonwoundhealinginvitro,whichmayprovidenewtheoreticalcluefortheresearchanddevelopmentofgrapheneoxiderelatedtissueengineeringmaterials.Objective:ToobservetheeffectsofGrapheneoxide(GO)onthewoundhealinginmice,andexploreitspossiblemechanism.Methods:1.PreparationofthebiomimeticGO-TPUnanohybridporousmembrane.ThebiomimeticGO-TPUnanohybridporousmembranescontainingdifferentmassfractionofGOweresuccessfullypreparedviathemethodcombiningparticlefiltrationandwetprocess.2.TheeffectsofbionicGO-TPUnanohybridporousmembraneonwoundhealingoffull-thicknessskindefectsinmice.4 陆军军医大学硕士学位论文(1)Establishmentofthebackfull-thicknessskindefectmodelinmice.ThehaironBalb/cmouse’sbackskinwasshavedoff,andthenpunchedonthebackskintomanufacta4mmdiametercircularskindefect;(2)Treatmentofwoundinmice.ThebiomimeticGO-TPUnanohybridporousmembranescontainingdifferentmassfractionofGOwereusedaswounddressingstoclosethewound,andwoundswithoutanytreatmentwereusedastheblankcontrolgroup.(3)ObservationandquantitativeanalysisofwoundhealingThewoundhealingandhealingtimewereobservedandrecordedatthepresettimepoints,andtheAdobePhotoshopCC2015softwarewasusedforquantitativeanalysistocalculatethewoundhealingrate.(4)Histopathologicalobservationandquantitativeanalysisofwoundtissue.Onthe3rddayand7thdaypostsurgery,thewound’stissueswerecollectedandthepathologicalsectionsofthewoundtissueswereprepared.Thenthelengthofthenewlyformedepitheliumwasmeasuredquantitativelyafterhematoxylinandeosin(H&E)staining.3.TheeffectsandmechanismsofGOonHaCatmigrationinvitro.HaCaTcells,ahumanimmortalizedepidermalcellline,wereselectedtoexplorethepotentialeffectsandpossiblemechanismsofgrapheneoxideonwoundhealinginvitro.Inbrief,HaCaTcellswereculturedwithRPMI1640mediacontainingvariousconcentrationsofGOfor24~72h.ThecellviabilityandproliferationwerecheckedbyCCK-8.Thecellmigrationswereassayedinacellscratchmodel.Thecytoskeletonswereobservedbyconfocallaserscanningmicroscope(CLSM).Moreover,thechangesofPCNA,F-actinandVinculinexpressionsaffectedbyGOweredetectedviaWesternblot.Results:1.ThebionicGO-TPUnanohybridporousmembranescanacceleratewoundhealingandshortenhealingtimebypromotingthenewlyepitheliumformed.(1)TheeffectsofbionicGO-TPUporousmembraneonwoundhealingrateandhealingtimeinmice.5 陆军军医大学硕士学位论文Intheanimalexperiment,apieceofsterilized(Φ=6.0mm)GO-TPUmembraneswithdifferentmassfractionofGOwasdressedonthebackwound.Thewoundsoncontrolgroupwerewithoutanytreatment.Theaveragehealingratesofwoundsineachgroupwas67.46%,81.70%and87.97%ontheday7postsurgery,andtheaveragehealingtimesofeachgroupwere12.75days,10.63daysand9.75days,indicatingthatthebiomimeticGO-TPUporousmembranecouldpromotethewoundhealinginmice.Forthermore,theeffectsofGO(0.1wt%)-TPUgrouponwoundhealinginmicewerebetterthanthatinpureTPUgroup.(2)GOincreasingthenewlyformedepitheliumlengthinmiceOntheday3andday7postsurgery,thelengthofnewlyformedepitheliumintheGO(0.1wt%)-TPUgroupwasthelongestamongallexperimentalgroups.On7thdaypostsurgery,theaveragelengthesofthenewlyformedepitheliumintheblankcontrolgroup,GO(0wt%)-TPUgroupandGO(0.1wt%)-TPUgroupwere575.66μm,831.46μmand1307.11μmrespectively.2.TheeffectsofGOonHaCaTcellsanditspreliminarymechanisms.Comparedwiththecontrolgroup,therewasnodifferenceincellviabilitywithin24hincubation,whileGOataconcentrationhigherthan1.0µg/mLexhibitedobviouscytotoxicity(P<0.01).ThePCNAexpressionleveldecreaseddramaticallyafter24hincubationwithGOat10.0µg/mL(P<0.05),whichindicatedthatthetoxincyteofGOcouldinhibitcellproliferationathighconcentration.Thescratchassayresultshowedthattherewasnodifferenceincellmigrationafter6hincubation.Thecellmigrationrateincreasedenormouslyafter12hand24hincubationwithGOat0.01µg/mL(P<0.01).Moreover,itwasdemonstratedbytheCLSMthatcellcilianumberincreasedremarkablyandcellstressfibersbecamethickerafterincubation.However,GOat1.0µg/mLconcentrationcouldobviouslyinhibitcellmigration(P<0.01).TheF-actinexpressionlevelincreasedsignificantlyafterincubationwithGOat0.01µg/mL,whiledecreasedafterincubationwithGOat1.0µg/mL(P<0.05).Notably,VinculinexpressionlevelincreasedbyGOwithaconcentrationdependentmanner.6 陆军军医大学硕士学位论文Conclusion:1.GOinTPUnanohybredporousmembranescanacceleratewoundhealingandshortenwoundhealingtimebypromotingthere-epithelializationofwoundsurface.2.SuitableconcentrationofGOcanpromotethemigrationofHaCaTcells,buthaslittleeffectsoncellmorphology,activityandproliferation.ThemechanismmayberelatedtotheeffectofGOonthechangesofcytoskeletonrearrangementandtheexpressionofF-actinandVinculin.Keywords：grapheneoxide;woundhealing;woundre-epithelialization;biomimeticdressing;cellmigration;F-actin;Vinculin;concentrationdependent7 陆军军医大学硕士学位论文氧化石墨烯对小鼠皮肤创面愈合的影响及初步机制研究中文摘要研究背景皮肤作为人体最大器官，是机体与外界环境间的天然屏障。它具有保护机体免受外界物理、化学损伤及病原微生物侵袭；防止机体内水、电解质以及各种营养物质流失；感知外界环境，引起相应神经反射，使人能够趋利避害；另外皮肤的角质层、皮脂腺等具有吸收功能，同时还可以分泌汗液、皮脂，是人体体温调节系统的重要成员，也是心理和免疫器官。因此，皮肤在维系人类身心健康方面发挥不可替代的作用。然而，随着社会不断发展，皮肤损伤逐渐成为临床最常见的疾病之一，比如各种事故伤、交通伤以及糖尿病溃疡、血管性病变等诸多因素和病症都或多或少会引起皮肤急性或慢性损伤，严重影响人类健康及日常生活。皮肤损伤后修复是在多种组织细胞和非细胞成分协同作用下完成，并依靠机体精密调控的一个极其复杂的病理生理过程。再上皮化是创面修复的基本过程和中心环节，在皮肤机械屏障完整性重建过程中发挥至关重要的作用。而表皮细胞增殖同时由创周等向创面中心迁移行为的过程是贯穿上述事件的关键步骤，已成为创面修复领域的研究热点和焦点。2石墨烯是一种碳原子以sp杂化轨道组成的六角形二维蜂窝状晶格平面薄膜材料，具有高导热系数、高机械强度、高电子迁移率、高比表面积和低密度、低电阻等物理化学特性，使其在光学、力学、电子、航天等领域具有极大的应用前景。氧化石墨烯作为石墨烯最重要的衍生物之一，由于表面大量的羟基、羧基、羰基以及环氧基等亲水性含氧基团，使其比石墨烯具有更好的生物相容性和水溶液稳定性，同时更便于化学功能修饰，而被广泛应用于生物医学领域研究。但氧化石墨烯对表皮细胞的增殖、迁移等行为是否具有调控作用，目前尚无相关文献报道。表皮细胞迁移是细胞的定向移动，是一个主动耗能过程，需要细胞骨架，尤其是由肌动蛋白组成的微丝骨架的参与。肌动蛋白是一个动态过程，其解聚和重排的协同调控在维持细胞形态变化及细胞迁移过程中发挥重要作用，进而会影响创面修复的发生、发展。因此充分研究氧化石墨烯与表皮细胞间的相互作用和分子机制，对研发新的创面修复方法和策略起非常重要的作用。故本实验首先观察和评估了氧化石墨烯对8 陆军军医大学硕士学位论文小鼠全层皮肤缺损修复的影响，然后选取HaCaT细胞作为研究模型，体外探讨氧化石墨烯影响皮肤创面愈合的潜在机制，以为氧化石墨烯相关组织工程材料的研制和开发提供新的理论支撑和策略支持。目的本研究以热塑性聚氨酯弹性体(ThermoplasticPolyurethanes，TPU)为支架材料，采用粒滤-湿法工艺成功将氧化石墨烯(Grapheneoxide,GO)引入到TPU支架中，通过建立小鼠全层皮肤缺损模型，来观察评估GO在小鼠创面愈合中的作用。然后通过体外实验，以人表皮细胞株-HaCaT细胞为研究对象，观察GO对HaCaT细胞形态、活性、增殖及迁移的影响，并利用倒置相差显微镜、细胞划痕实验、细胞骨架染色、蛋白印迹法等初步探讨其可能机制，为GO在促创面愈合敷料方面的研制及应用提供一定的实验基础和理论支撑。方法1.GO-TPU多孔膜的制备利用粒滤-湿法工艺成功制备GO-TPU多孔膜。2.GO对小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响(1)建立小鼠背部全层皮肤缺损创面模型Balb/c小鼠背部皮肤脱毛备皮，打孔器辅助制造直径为4mm的圆形全层皮肤缺损创面；(2)创面皮肤处理以含不同质量分数GO的GO-TPU多孔膜作为创面覆盖物封闭创面，同时设立空白对照组；(3)创面愈合情况观察及量化分析在预设时间点观察和记录各组创面愈合情况及愈合时间，利用AdobePhotoshopCC2015软件行量化分析，计算创面愈合率；(4)创面组织病理学观察及量化分析于造创后第3天和第7天，分别对各组创面组织进行取材并制备病理切片，然后采用苏木素-伊红染色，观察并测量各组创面新生上皮长度，同时进行量化分析。3.体外GO对人永生化表皮细胞株-HaCaT的影响及机制探讨将HaCaT细胞分别应用于GO终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1.0、10.0μg/mL的RPMI1640细胞培养液培养，并在培养的不同时相点，应用CCK-8试剂盒检测细胞活性，蛋白印迹法检测PCNA表达。同时采用划痕实验检测细胞迁移情况，激光共9 陆军军医大学硕士学位论文聚焦显微镜观察细胞骨架改变，蛋白质印迹法检测细胞F-actin、Vinculin的表达。结果1.GO对小鼠创面愈合的影响(1)GO对小鼠创面愈合率及愈合时间的影响在动物实验中，分空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组分别处理小鼠创面，在造创后第7天各组创面平均愈合率分别为67.46%、81.70%和87.97%，各组平均愈合时间分别为12.75天、10.63天和9.75天，说明GO-TPU多孔膜可以促进小鼠创面愈合，并缩短创面愈合时间，其中GO(0.1wt%)-TPU组效果优于纯TPU组。(2)小鼠创面组织切片病理学分析造创后第3天和第7天，分别对创面组织进行取材、固定、制片和HE染色，发现GO(0.1wt%)-TPU组创面新生上皮长度在各实验组中最长。在造创后第7天，空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组处理小鼠创面新生上皮平均长度分别为575.66μm、831.46μm和1307.11μm。2.体外GO对人表皮细胞株-HaCaT的影响及初步机制研究(1)在培养24h内，各组GO对HaCaT细胞活性无影响，但发现随GO浓度逐渐升高及培养周期逐渐延长，其毒性逐渐增强；另外发现培养24h，10.0μg/mLGO可明显抑制细胞PCNA表达(P<0.05)。(2)划痕实验结果显示：低浓度GO可促进HaCaT细胞迁移，其中以0.01μg/mL浓度效果最明显，在划痕后24h，该组细胞迁移面积比对照组增加35.33%(P<0.01)。(3)激光共聚焦显微镜观察发现：0.01μg/mLGO刺激后，细胞纤毛明显增多，胞内应力性纤维增粗；而其1.0μg/mL组细胞变小、变圆。(4)蛋白印迹法检测结果显示：0.01μg/mLGO刺激后F-actin表达增加（P<0.05），而1.0μg/mL作用后F-actin表达却明显低于对照组；GO能促进Vinculin表达，但仅当GO浓度达到0.01μg/mL后才有统计学差异。结论1.GO-TPU多孔膜复合材料通过促进创面新生上皮生长，进而加速创面愈合，缩短创面愈合时间，其中含0.1wt%GO的GO-TPU组效果优于纯TPU组，说明GO在复合材料促进创面愈合过程中发挥积极作用；2.适当浓度的GO可促进HaCaT细胞迁移，且对细胞形态、活性以及增殖变化影响较小，其机制可能与GO影响细胞骨架重排及F-actin、Vinculin表达有关。10 陆军军医大学硕士学位论文3.GO对HaCaT细胞行为的影响可能是GO在复合材料中发挥促进创面愈合作用的潜在机制，但还需进一步研究探讨。关键词：氧化石墨烯；创面修复；创面再上皮化；仿生敷料；细胞迁移分析；肌动蛋白；粘着斑蛋白；浓度依赖11 陆军军医大学硕士学位论文氧化石墨烯对小鼠皮肤创面愈合的影响及初步机制研究第一章前言皮肤作为人体最大的器官，是机体免受外界物理性、化学性和机械性损伤以及病原微生物入侵的天然屏障，同时在维持机体体液平衡和电解质稳定方面发挥关键作用[1]。一旦其完整性受损，特别是全层皮肤缺损的大面积深度创面，机体通常无法迅速完成自然愈合，而需要依赖安全、有效的创面敷料来对缺损部分进行快速封闭及保护[2,3]。目前观点普遍认为，创面敷料在理想状态下应包含如下特点：具有适宜的水蒸气透过率、良好的力学性能、优异的生物相容性以及较强的抗感染能力等。此外更为重要的是，创面敷料尤其是其基础材质还应具有一定的可塑性，比如通过改性等手段持续改进、改良其生物学性能及理化性质，以使其具备维持局部创面适度的湿润、温度及无菌状态等需求能力，从而创立一个有利于创面再生的微环境[1-3]。此外还值得注意的是，材料学家及临床一线医生普遍希望研制的敷料本身应具备良好促进创面修复的能力。因此，兼具上述优点的创面敷料已逐渐成为目前创面敷料研究领域的热点及重点。但是，当前临床治疗中普遍应用的敷料尚不能完全满足上述特性。近年来，随着不断发展的材料科学及生物医学技术，例如藻酸盐、壳聚糖、明胶、胶原及聚氨酯等单体及改性新型材料已被广泛应用于制备不同类型的敷料[4,5]。以上新型敷料均有较多的文献报道，且具备较多优势同时兼具促进创面修复性能，但是此类敷料各自不足之处也较为明显，例如有的材料水蒸气透过率不适合进而易使创面积液或干燥，有的材料力学性能差因而不能对创面进行有效保护，有的材料更关键的缺陷在于其缺乏有效的抗感染能力，亦或容易造成创面耐药菌感染，还有部分材料制备成本较高、流程也十分复杂，这些缺陷均导致上述新材料的应用和推广受到一定的限制[6,7]。石墨烯是一类由单层碳原子组成的二维蜂窝状晶格结构物质，由于其优良的导电性和热性能，独特的光学行为，优异的机械性能和极大的比表面积，而被认为是重要的新型纳米材料和量子行为模型体系，并广泛应用于工业领域。近年来的研究还发现，石墨烯具有优良的生物相容性和抗菌性能，同时还可以促进组织再生，从而被应用于生物医学领域[8]。氧化石墨烯是石墨烯最重要的衍生物之一，其表面含有多种亲水性含氧官能团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等[9,10]，这些基团使其与石墨烯相比，具有更加良好的水溶性及易修饰性，同时能提供更大的比表面积和更强的表面活性。12 陆军军医大学硕士学位论文已有文献报道，氧化石墨烯可以促进干细胞的粘附和增殖，增强其向不同胚层细胞分化的能力[11-15]。ElkhenanyH等[14]发现石墨烯可以促进山羊成体骨髓间充质干细胞的体外附着和增殖，同时可以提高其向成骨细胞分化的能力。氧化石墨烯还能增强脂肪源性干细胞向脂肪组织和上皮组织分化的能力[15]。另外还有研究发现氧化石墨烯不仅可以单独作为调控干细胞的载体材料，还可以加入到现有的一些支架材料中，起到改善支架机械性能和空间构造的作用，以增强其生物学活性[16-20]。DubeyN等[17]以碳纳米管和石墨烯分别修饰聚乳酸支架，然后与骨髓间充质干细胞进行共培养，发现以石墨烯修饰的支架可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，同时能够增进钙盐沉积以及I型胶原形成。氧化石墨烯还可以增强支架材料的机械性能，维持支架结构的完整性和三维结构，从而为细胞增殖、分化等提供良好的微环境[19]。以上研究表明石墨烯及其衍生物具有调控细胞行为的潜能。而氧化石墨烯对皮肤细胞的研究则鲜有报道。作为一种兼具自我更新、慢周期性的多能细胞，表皮干细胞在创面修复及维持皮肤表皮正常更新中作用显著[21]。目前研究普遍认为，表皮干细胞主要在毛囊外鞘隆突部、表皮细胞基底层以及皮脂腺中分布[22-25]，其中毛囊外鞘隆突部的表皮干细胞可有效维持皮肤表皮更新及促进创面再上皮化[22,24]。而表皮基底层干细胞不仅可以促进创面再上皮化，还具有维持皮肤新陈代谢及表皮更新的作用。另外，表皮干细胞处在“干细胞巢”的特定微环境中，这对其自身生物学功能及干性状态维持意义重大[21-25]。一旦机体形成创面，创周等部位的基底层和毛囊外鞘隆突部干细胞在多种信号分子的共同调控下发生活化，从而通过不对称分裂而形成增殖，并从“干细胞巢”离开，迁移至机体创面部位来完成创面再上皮化[25,26]，重建皮肤屏障。现研究普遍认为，哺乳动物皮肤的创面愈合过程包括凝血期、炎症期、新生组织形成及组织重塑等四个阶段[27,28]，其中新生组织的形成则始于新生表皮组织迁移并对受损真皮进行覆盖。因而，表皮干细胞不仅仅已成为临床实践中治疗慢性难愈创面的重要候选细胞，还作为研制创面敷料、人工皮肤临时替代物等相关组织工程学学材料的重要种子细胞，备受材料学家以及临床研究者的关注和青睐。皮肤损伤后愈合修复是一个极其复杂的病理生理过程，需要许多组织细胞和非细胞成分参与其中。再上皮化是创面愈合的基本过程与重要表现，其主要依靠表皮细胞增殖并由创周等向创面中心迁移，该过程是决定创面愈合的关键环节之一[29,30]。创伤后表皮干细胞定向移动是一个主动耗能过程，需要细胞骨架系统参与。已有文献报道，肌动蛋白（F-actin）是细胞微丝骨架的主要组成成分，是细胞运动的主要动力，13 陆军军医大学硕士学位论文其聚合、解离、重排及形态变化在细胞迁移中发挥至关重要的作用[31-35]。如有学者研究发现细胞运动过程中，肌动蛋白会在运动细胞伪足前沿密集排列，并积极参与细胞伪足前沿的延展和形态组建[36]。肌动蛋白的动态结构，比如应力纤维[37,38]、丝状伪足[39]及板状伪足[40]，同样在细胞迁移中发挥作用[37,41]。应用Rho蛋白抑制剂可使细胞微丝骨架解离，从而使细胞皱缩，进而使细胞迁移能力下降[42,43]。因此结合氧化石墨烯对细胞的潜在影响，我们首先研究了氧化石墨烯对小鼠创面愈合的影响，然后以表皮细胞株HaCaT细胞为研究对象[44]，通过体外观察氧化石墨烯对细胞形态、活性、增殖以及迁移的影响，并利用电镜观察、细胞划痕实验、细胞骨架染色、蛋白印迹法等方法来初步探讨其可能机制，为氧化石墨烯促创面愈合敷料的研制及应用提供一定的理论基础和支撑。14 陆军军医大学硕士学位论文第二章氧化石墨烯对创面愈合的影响2.1研究背景随着材料科学以及制备技术的迅猛发展，许多人工合成材料和天然材料，如硅橡胶、聚乳酸、聚乙烯醇以及壳聚糖、甲壳素等，由于合成成本低廉，生物相容性良好，而被认为是用作制备创面敷料很好的基础材料[4,5,45-47]。以上材料由于各自优良的性能，已开始被合成各种类型的创面敷料而应用于临床工作，虽然种类繁多，但往往因结构单一或功能局限而存在各自不同的缺陷，使用效果也参差不齐，从而限制其在临床的广泛应用[2,6,7,48,49]。另外材料学家也希望通过改良创面敷料基材和改善制备技术使研制的创面敷料本身就具备良好促进创面修复的能力，以提高创面修复质量。2石墨烯是一类碳原子以sp杂化轨道组成的具有二维蜂窝状结构的单层平面薄膜材料，由于其独特的理化性质和良好的生物相容性，已被广泛应用于工业等领域[50]。氧化石墨烯(GrapheneOxide,GO)是石墨烯最重要的衍生物之一，表面含有多种亲水性含氧官能团，如羟基、羧基、羰基、环氧基等，上述基团使其比石墨烯具有更加良好的水溶性及易修饰性，这些特点使得氧化石墨烯更易与各种类型的细胞以及聚合物发生相互作用[9-10,51]。比如有研究显示氧化石墨烯能促进多能干细胞的粘附、增殖，并刺激他们分化成不同谱系[11-15]。以上研究成果提示石墨烯及其衍生物具有调控细胞行为的潜能，并有望作为填料以赋予创面敷料特定生物学性能。热塑性聚氨酯橡胶，又称热塑性聚氨酯弹性体(ThermoplasticPolyurethanes,TPU)，是一种类似皮肤组织特性的柔性弹性体，具有生物相容性好以及化学性质稳定和易加工性，且价格低廉，被公认为是一种绿色环保、综合性能优异的有机高分子材料，已经被FDA批准并广泛应用于医疗产品[48,52,53]。因此，为了研究GO对创面愈合的影响，我们以TPU为支架材料，采用粒滤-湿法工艺成功合成了含有不同质量分数GO的仿生GO-TPU多孔膜复合材料，通过建立小鼠全层皮肤缺损模型，来观察GO-TPU膜对小鼠创面愈合的影响。2.2材料与方法2.2.1实验材料2.2.1.1主要实验设备仪器名生产厂家15 陆军军医大学硕士学位论文小动物实验操作台中国苏州净化医疗设备公司记号笔中国广州加名医疗器械公司打孔器中国上海汉顿工具厂电子天平德国Sartorius公司聚四氯乙烯模具自制无菌医用敷贴中国江西3L医用制品厂眼科器械(剪、镊)中国上海医疗器械厂数码相机日本Pentax公司电动剃毛器中国上海飞科集团无菌注射器中国苏州碧迪医疗器械厂DM6000B型光学显微镜德国Leica公司电热恒温水浴锅中国上海医疗器械七分厂恒温干燥烘箱中国上海一恒科学仪器厂高压蒸汽灭菌锅中国上海申安医疗器械厂恒温干燥烘箱高压蒸汽灭菌锅中国上海申安医疗器械厂石蜡切片机德国Leica公司冰冻切片机德国Leica公司防脱载玻片中国世泰实验器材公司盖玻片中国武汉博士德生物公司2.2.1.2主要实验药品及试剂试剂名称生产厂家氧化石墨烯(GrapheneOxide,GO)美国Sigma公司热塑性聚氨酯弹性体(TPU)美国Lubrizol公司N,N-二甲基间酰胺(DMF)中国成都科龙化工厂分析纯硫酸(H2SO4)中国成都西陇化工有限公司分析纯盐酸(HCl)中国成都西陇化工有限公司分析纯高锰酸钾(KMnO4)中国成都科龙化工厂分析纯正己烷中国成都科龙化工厂液体石蜡(LP)中国成都科龙化工厂四氢呋喃(THF)中国成都科龙化工厂柠檬酸钠粉剂中国成都科龙化工厂16 陆军军医大学硕士学位论文戊巴比妥钠粉剂美国Sigma公司脱毛膏法国Veet公司75%医用酒精消毒液中国山东历尔康医疗科技医用碘伏中国四川华天科技公司PBS粉剂中国武汉博士德生物公司注射用青霉素钠粉剂中国西南药业公司4%多聚甲醛中国武汉博士德生物公司二甲苯中国重庆化工厂无水乙醇中国重庆化工厂Mayor苏木素中国Solarbio公司伊红中国Solarbio公司中性树脂中国Solarbio公司2.2.1.3实验动物SPF级Balb/c小鼠(雄性，20-25g)，购自解放军陆军军医大学实验动物中心(许可证号：SYXK(渝)2012-0002)。饲养环境：SPF级动物饲养间，室温25℃，相对湿度(RH)50%，昼夜节律12h。每次动物实验前小鼠以单笼形式分开饲养，并于本实验室动物房提前适应饲养1周。所有动物实验操作流程均按陆军军医大学实验动物伦理委员会相关伦理要求和动物福利条例执行。2.2.1.4实验试剂的配制(1)戊巴比妥钠溶液(1%)：取100ml无菌生理盐水，加入1g戊巴比妥钠粉剂，充分摇匀溶解，密封后4℃冷藏保存；(2)柠檬酸钠溶液取1000ml双蒸水(ddH2O)，加入1袋柠檬酸钠粉剂，搅拌均匀充分溶解后备用。2.2.2实验方法2.2.2.1仿生GO-TPU多孔膜的制备(图2.1)(1)制备筛选柠檬酸钠颗粒：将柠檬酸钠粉末倒入至高速搅拌机中粉碎，以100目筛网过筛备用；(2)配制涂膜液：称取12.5gTPU粉末颗粒，在60℃、300rpm条件下均匀机械搅拌，使其充分溶解于100mlDMF中；(3)称取60g步骤(1)中过筛后的柠檬酸钠颗粒和GO粉末，加入至步骤(2)溶液中，17 陆军军医大学硕士学位论文并机械混匀，然后在0.06-0.08MPa条件下脱泡10min；(4)将上述悬浮液倒入聚四氟乙烯模具中，然后再将模具浸没于盛有500ml无水乙醇容器中，静置12h，使TPU完全固化；(5)取出固化的TPU膜并移至去离子水中，浸泡72h，完全去除残留的柠檬酸钠颗粒；(6)取出TPU膜放置于40℃恒温烘箱烘干备用。图2.1仿生GO-TPU多孔膜的制备2.2.2.2仿生GO-TPU多孔膜的小鼠创面愈合实验2.2.2.2.1制作Balb/c小鼠全层皮肤缺损模型及创面处理(1)小鼠备皮造创前一天对小鼠进行脱毛备皮：以1％戊巴比妥钠溶液(0.01ml/g)行腹腔注射麻醉后，电动剃毛器剃除小鼠背部皮肤毛发，于残余毛发上均匀涂抹一层脱毛膏，轻柔按摩2min左右，然后以棉球轻轻地将脱毛膏和剩余毛发擦拭掉，并以温水棉球将备皮区擦拭干净，同时小鼠注意保暖；待麻醉清醒后分开单笼饲养；(2)造创麻醉方法同上，然后按课题组前期报道的小鼠皮肤缺损模型建立方法进行[54]。即：待麻醉成功后小鼠取俯卧位，以碘伏棉球擦拭小鼠背部皮肤3次，75%酒精棉球脱碘；以记号笔和直尺在预造创部位做好标记，之后两人协同操作，以打孔器在标记18 陆军军医大学硕士学位论文部位打孔完成造创，孔径约4mm；(3)记录造创完毕后将小鼠重新置于俯卧位，距创缘1-2mm处放一自制圆片用作标尺(直径4mm)，数码相机拍照记录(注意拍照时保持镜头同时垂直于创面和标尺，并对焦准确以保持拍摄质量)。另外注意在整个动物实验过程中可用含生理盐水或PBS缓冲液棉球轻柔擦拭创面，以确保创面时刻保持湿润状态；(4)创面处理①先将GO-TPU多孔膜制成直径为6mm的圆片，75%酒精浸泡30min消毒，60然后PBS缓冲液漂洗以彻底去除酒精备用；或以Co辐照灭菌；②实验分为3组，即空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组。首先将创面以含有抗生素生理盐水的棉球擦拭一遍，无菌棉球蘸干，然后将上述备好的敷料分别覆盖于创面上，并以无菌3L敷贴固定。空白对照组不做处理，仅以无菌3L敷贴封闭；(5)观察记录分别于造创后第3、5、7天更换敷料，同时按步骤(3)中方法拍照记录，并确保整个动物实验期间创面敷料在位固定牢靠。2.2.2.2.2小鼠创面愈合过程中相关数据的测量与记录(1)小鼠创面的测量利用AdobePhotoshopCC2015软件，对创面记录图片进行测量分析，并根据创缘旁边圆片标尺大小计算预设时相点创面的实际大小：①在PS中打开图片，调整图片大小以使创面及圆片标尺位于屏幕中央；②首先在“快速选择”工具箱中勾选“多边形套索工具”，然后分别紧贴创面及圆片标尺边缘选取范围，并点击“窗口”下拉菜单中的“记录测量”，记录其中“面积”一栏数值，得到创面及圆片标尺像素面积；③通过比例尺换算获得创面面积；(2)计算小鼠创面愈合率按如下公式计算小鼠创面愈合率：(第0天创面面积－伤后第n天创面面积)创面愈合率=×100%第0天创面面积19 陆军军医大学硕士学位论文2.2.2.2.3小鼠创面组织标本的收集及切片制作(1)创面组织标本的收集①同上述方法建立小鼠全层皮肤缺损模型及创面处理。②于造创后第3天和第7天处死实验小鼠，以眼科剪和眼科镊协同操作对创面组织进行取材，标本边缘距创缘约2-3mm；③适当修剪创面标本后于滤纸上铺平，然后从中间剪开一分为二，分别浸泡在含有1ml4%多聚甲醛的EP管中，4℃静置24h；(2)制作创面组织标本石蜡切片①组织块脱水：取固定好的创面组织，依次将其浸泡在50%、70%、80%、95%、100%以及100%的酒精中，每种约2h，对创面组织进行脱水处理；②组织块透明：将脱水后的组织浸泡在体积比为1:1的二甲苯-乙醇混合溶液中2h，再置于纯的二甲苯溶中2h，然后更换成新的二甲苯溶液再浸泡2h；③将组织块置于体积比为1:1的二甲苯-石蜡混合粉末中，40℃烘箱预处理1h，然后升温至60℃过夜；④取出组织块至纯的石蜡溶液中浸泡2h，然后更换1次石蜡溶液再浸泡2h；⑤取出组织块置于包埋框中，然后摆好位置并加满石蜡，标记，冷却凝固；④取出并修整石蜡块，然后摆好位置置于切片机上，调整刀片角度后开始切片，厚度为5μm；⑤将标本切片移至水槽中，以防脱玻片捞取标本切片，同时要注意使玻片上的标本切片充分展开铺平，然后移至40℃烘箱烘烤过夜。2.2.2.2.4小鼠创面组织切片的HE染色及观察、测量(1)取出小鼠创面组织切片并置于60℃烘箱烘烤1h；(2)取出烘烤后的组织切片，并依次将其浸泡在二甲苯I溶液、二甲苯II溶液、无水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精以及蒸馏水中，时间分别为10min、10min、5min、5min、5min、5min、5min、5min；(3)苏木素染色5min，之后自来水冲洗1min；(4)75%盐酸乙醇溶液分化3-5s后自来水冲洗1min；(5)伊红染色1min，之后自来水冲洗1min；(6)取出组织切片，再次将其依次浸泡在50%酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、无水乙醇、二甲苯II溶液以及二甲苯I溶液中，时间分别为5min、5min、5min、5min、5min、10min、10min；20 陆军军医大学硕士学位论文(7)取出后盖上盖玻片，并以中性树胶封皮；(8)待树胶完全固化后于显微镜下观察并拍照记录。创面新生上皮长度的测量方法参照相关文献[2]进行，即以创缘为测量起点，新生上皮最前端为其终点，两者间的直线距离即为新生上皮长度。以上测量与数据分析由不同病理专家采取随机双盲的方式完成。2.2.3统计学分析及做图实验所得数据以±s形式表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两独立样本比较行样本t检验，多个样本中的两两比较行LSD检验(软件自动略去该统计量值)，组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05，以P值<0.05提示存在统计学意义上差异，P值>0.05提示无统计学意义差异。文中使用GraphpdaPrism6软件绘图。2.3实验结果2.3.1仿生GO-TPU多孔膜对小鼠创面愈合的影响为了评估仿生GO-TPU多孔膜复合材料在创面愈合中的作用，我们建立了小鼠全层皮肤缺损模型，并使用含有不同质量分数GO的仿生GO-TPU多孔膜分别处理创面，按预设时间点观察并记录创面愈合情况(图2.1A-C)，同时利用PS软件对创面大小进行量化分析，从而通过公式计算获得各实验组小鼠创面愈合率。结果显示(图2.1D)，与空白对照组相比，在造创后第5天和第7天，仿生GO-TPU多孔膜可以促进创面愈合，其中以GO(0.1wt%)-TPU组最为显著。造创后第5天，空白对照组、GO(0wt%)-TPU组以及GO(0.1wt%)-TPU组创面愈合率分别为47.81%、57.10%和70.30%，其中GO(0.1wt%)-TPU组创面愈合率在各组中最高；而伤后第7天，各组创面愈合率分别为67.46%、81.70%和87.97%。此外我们还统计和计算了各组小鼠创面的愈合时间(图2.1E)，其中GO-TPU组的平均愈合时间明显较空白对照组缩短，空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组创面平均愈合时间为12.75天、10.63天和9.75天。提示仿生GO-TPU多孔膜可以促进小鼠创面愈合，缩短创面愈合时间。21 陆军军医大学硕士学位论文A-C:创面愈合大体图，A:Conrol组(空白对照组)，B:GO(0wt%)-TPU组，C:GO(0.1wt%)-TPU组；D:创面愈合率分析；E:创面愈合时间分析；ns:P>0.05；*:P<0.05，**:P<0.01，****:P<0.0001，n=8图2.2不同处理后小鼠创面愈合实验2.3.2使用仿生GO-TPU多孔膜处理小鼠创面后创面再上皮化分析创面再上皮化是评价创面愈合非常重要的一个指标。因此我们通过对小鼠创面组织切片HE染色观察，并利用PS软件测量分析发现(图2.3)，造创后第3天，空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组创面新生上皮平均长度分别为277.64μm、478.96μm和775.19μm，提示使用仿生GO-TPU多孔膜处理创面后再上皮化速率明显高于无覆盖物组，其中含有0.1wt%GO的仿生GO-TPU多孔膜组新生上皮长度大于不含GO(0wt%)组，说明含有GO的仿生多孔膜在促进创面愈合方面效果优于纯TPU组。造创后第7天，GO(0.1wt%)-TPU组新生上皮平均长度在所有实验组中最长，各组创面新生上皮长度平均值分别为575.66μm、831.46μm和1307.11μm。22 陆军军医大学硕士学位论文A-F:创面组织切片HE染色，(A,D):Control组(空白对照组)；(B,E):GO(0wt%)-TPU组；(C,F):GO(0.1wt%)-TPU组；G:创面新生上皮长度定量分析(n=5)；***:P<0.001，****:P<0.0001图2.3不同处理后小鼠创面新生上皮分析2.4讨论在过去一段时间里，材料学家结合皮肤创面治疗理论和修复机制的研究成果，研制和开发了具备不同性能的多种新型创面敷料，比如可以抗粘附的、抗菌的以及药物缓释等等，对推动临床治疗，特别是大面积深度皮肤缺损创面，起到积极和不可替代的作用[55-57]。但随着研究的深入和治疗要求的提高，上述敷料也存在着各自不同的缺陷，特别是对敷料本身生物学性能的需求不断提升，从而极大限制了相关创面敷料的推广应用[2,48-49]。另外有学者发现生物支架或创面敷料本身的构造也会影响创面组组和细胞的再生[58-60]。Zeng等[58]报道生物支架的孔径及构造可以模拟机体的生长环境，从而影响细胞的粘附和增殖，3D培养体系可以促进表皮干细胞的增殖，增强其向汗腺细胞分化的能力，而进入2D培养体系后汗腺细胞分化就会终止[59]。因此，通过采用新型的生物材料和现代化的制造技术，结合并模拟正常皮肤的结构特点，以赋予创面敷料更多的生物学功能成为创面材料研发的新方向。结合以上研究成果，本次实验采用粒滤-湿法工艺，成功地将GO引入到TPU支架中，制备出含有不同质量分数GO的新型GO-TPU多孔膜，其上下表面平整，内部孔径呈上小下大分布，上述特点也赋予了所制备的GO-TPU多孔膜在结构上具有一定模拟正常皮肤构造的仿生特性。此外为了评估仿生GO-TPU多孔膜对创面修复的影响，我们建立了小鼠背部创面皮肤缺损模型，分空白对照组、GO(0wt%)-TPU组和GO(0.1wt%)-TPU组分别处理创面，并观察和记录创面愈合情况，同时测量和计算了创面愈合率以及创面组织切片HE23 陆军军医大学硕士学位论文染色新生上皮的长度。如图2.2所示，在造创后第5天和第7天，仿生GO-TPU多孔膜组的创面愈合率明显高于空白对照组，提示具有仿生结构的GO-TPU多孔膜可以促进创面愈合，这一点也在对创面愈合时间统计分析中得到证实。创面再上皮化是创面愈合的基本过程，是衡量创面愈合一个非常重要的指标。因此我们又对创面组织切片进行病理学观察和测量，通过量化分析，发现在造创后第3天和第5天，仿生GO-TPU多孔膜组创面新生上皮长度明显长于空白对照组。我们分析这可能得宜于材料的仿生结构，而为创面组织和细胞提供了一个更好的生长环境[58,59]。另外由于材料上表面孔径约为2.32μm，而且稀疏，从而使其具备了一定抵挡细菌的能力[61]。因此，我们通过以上研究可以得出仿生GO-TPU多孔膜通过促进创面组织再上皮化从而加速了创面愈合，缩短了创面愈合时间。然而具备仿生结构的GO-TPU膜促进创面修复的机制是什么？是因为孔径结构本身提供了类似皮肤愈合的三维环境还是孔径结构引起GO-TPU材料性能的改变？同时本研究中还发现含有0.1wt%GO的仿生GO-TPU多孔膜在促进新生上皮生长和创面面愈合方面效果优于纯的TPU组，这又是为什么呢，是GO本身对创面组织和细胞的影响，还是改变了复合材料的结构和性能？以上疑问目前尚无相关文献报道阐述，因此仍需进一步研究。24 陆军军医大学硕士学位论文第三章氧化石墨烯促进创面愈合的初步机制研究3.1研究背景作为一种新生纳米材料，石墨烯具有多种优良性能，已经成为材料学、物理学、化学以及生物医学等领域研究的焦点和热点[50]。氧化石墨烯作为石墨烯最重要的衍生物之一，由于表面富含羟基、羧基、羰基、环氧基等多种含氧官能团，使其比石墨烯具有更加良好的水溶性及易修饰性[51,62,63]。在前期的研究中，我们采用粒滤-湿法工艺成功地将GO引入到TPU支架中，制成了含有不同质量分数GO的仿生GO-TPU多孔膜复合材料。通过建立小鼠全层创面模型，并利用其处理小鼠创面，我们观察到仿生GO-TPU多孔膜相比空白对照组能促进创面愈合，缩短创面愈合时间，其中含有0.1wt%GO的GO-TPU组效果优于纯的TPU组(即0wt%GO)。利用对创面组织切片进行HE染色，我们发现GO(0.1wt%)-TPU组更促进创面新生上皮生长。以上体内实验结果引起了我们极大兴趣。课题组[2,48,49,61,64]前期的一些研究成果显示孔径结构的引入和模拟正常皮肤结构的仿生特性，可以通过给创面组织及细胞的粘附、生长等提供一个更好的微环境，从而发挥促进创面愈合的作用。而本次实验中我们也再次验证了上述结果，但同时我们还注意到含有GO的复合材料在促进小鼠创面愈合和新生上皮生长方面，效果要明显优于纯的TPU组，提示GO可能在复合材料促进创面愈合过程中发挥积极作用，那么GO在复合材料到底发挥怎么样的作用，其机理又是什么呢？因此我们通过以人永生化表皮细胞株-HaCaT细胞为研究对象，来探讨GO在皮肤创面愈合中的作用及潜在机制。3.2材料与方法3.2.1实验材料3.2.1.1主要实验设备仪器名生产厂家眼科器械(剪、镊)中国上海医疗器械厂细胞培养瓶(25ml和75ml)美国Corning公司细胞培养板美国Nest公司25 陆军军医大学硕士学位论文单道移液器德国Eppendorf公司(2.5µl、10µl、100µl、200µl和1000µl)滤器(0.20µm)美国MerckMillipore公司医用超净工作台中国苏州医用仪器设备厂压力蒸汽灭菌器中国上海申安医疗器械厂TGL-16G台式细胞离心机中国上海安亭离心机厂低温高速离心机(Eppendorf-200)德国BeckmanCoulter公司细胞培养箱美国ThermoScientific公司电热恒温水箱中国上海医疗器械七厂分厂普通光学显微镜美国Shelden公司倒置相差显微镜日本Olympus公司pH计德国Sartorius公司Molli-Q超纯水设备美国MerckMillipore公司电子天平德国Sartorius公司酶标仪Bio-RADModel550美国ThermoScientific公司盖玻片中国博士德公司防脱载玻片中国世泰实验器材公司荧光显微镜德国LeicaMicrosystems公司激光共聚焦扫描显微镜德国LeicaMicrosystems公司透射电子显微镜(TEM)荷兰Philips公司原子力电子显微镜(AFM)美国AsylumResearch公司微量移液枪美国Gilson公司半干电转仪美国Bio-Rad公司SDS-PAGE电泳系统美国Bio-Rad公司紫外/可见光凝胶成像系统美国Bio-Rad公司水平摇床中国北京沃德生物仪器厂-4℃/-20℃低温冰箱中国海尔公司-80℃低温冰箱美国Thermo公司3.2.1.2主要实验药品及试剂试剂名称生产厂家氧化石墨烯(GrapheneOxide,GO)美国Sigma公司26 陆军军医大学硕士学位论文RPMI1640培养基美国Invitrogen公司胎牛血清美国Hyclone公司注射用青霉素钠中国重庆西南药业公司注射用硫酸链霉素中国山东鲁抗医药集团PBS粉剂中国武汉博士德生物公司0.25%胰蛋白酶美国Gibco公司DMSO美国Sigma公司CCK-8试剂盒日本同仁化学研究所75%酒精消毒液中国山东历尔康医疗科技医用碘伏中国四川华天科技4%多聚甲醛中国武汉博士德生物公司全蛋白提取试剂盒中国江苏凯基生物公司BCA蛋白定量试剂盒美国Pierce公司无水乙醇中国重庆化工厂二甲苯中国重庆化工厂30%丙烯酰胺中国上海西宝生物科技三羟甲基氨基甲烷(Tris)中国上海西宝生物科技十二烷基硫酸钠(SDS)中国上海西宝生物科技过硫酸铵(AP)美国Sigma公司四甲基乙二胺(TEMED)美国Sigma公司Tween-20美国Vetec公司预染蛋白Maker美国MerckMillipore公司PVDF膜美国MerckMillipore公司牛血清白蛋白(BSA)中国武汉博士德生物公司兔抗PCNA抗体英国Abcam公司兔抗F-actin抗体英国Abcam公司兔抗Vinculin抗体美国Sigma公司GAPDH英国Abcam公司鼠抗𝛽-actin英国Abcam公司HRP-山羊抗鼠IgG二抗中国武汉博士德生物公司HRP-山羊抗兔IgG二抗中国武汉博士德生物公司27 陆军军医大学硕士学位论文DAB显色发光液美国Pierce公司FITC-鬼比环肽中国Solarbio公司DAPI染色液中国碧云天公司抗荧光淬灭封片剂中国碧云天公司3.2.1.3实验动物及标本人永生化表皮细胞株-HaCaT细胞，购自美国ATCC中心，由本课题组保存于液氮罐中。实验前复苏并常规培养1周左右。3.2.1.4实验试剂的配制(1)RPMI1640培养基：取1000ml去离子水，加入1袋RPMI1640干粉，2.0gNaH2CO3，0.2gL-谷氨酰胺，2.0gHEPEs，100,000U青霉素，100,000μg链霉素，充分搅拌溶解，以HCl较调pH至7.2，0.22μm滤器过滤除菌，密封后4℃冷藏保存；每次使用前加入体积分数为10%FBS；(2)PBS缓冲液：取1000ml双蒸水(ddH2O)，加入1袋PBS缓冲液粉剂，充分搅拌溶解，以HCl较调pH至7.4，高温高压消毒灭菌，4℃冷藏保存；(3)10%SDS溶液：取100ml双蒸水(ddH2O)，加入10.0g十二烷基硫酸钠(SDS)，充分搅拌溶解，室温保存；(4)10%AP溶液：取100ml双蒸水(ddH2O)，加入10.0g过硫酰胺(AP)，充分搅拌溶解后分装，-20℃冷冻保存；(4)蛋白裂解液：按全蛋白提取试剂盒(凯基生物，KGP250)操作规程，分别加入LysisBuffer、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂以及PMSF(100mM)各1ml、10μl、lμl、5μl，震荡混匀后置于冰盒上，现配现用；(5)TBS(10×)溶液：取900ml双蒸水(ddH2O)，加入80.50g氯化钠粉剂(NaCl)，24.20g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，以ddH2O定容至1000ml，充分HCl较调pH至7.4后室温保存，此作为储存液；(6)TBST(1×)溶液：28 陆军军医大学硕士学位论文取900ml双蒸水(ddH2O)，加入100mlTBS(10×)溶液，1ml吐温-20(Tween-20)，充分搅拌混匀，室温保存；(7)12%SDS－PAGE分离胶(2块)：取去离子水4.9ml，依次加入6.0ml30%丙烯酰胺，3.8mlTris-HCl(1.5M，pH8.8)，0.15ml10%SDS混匀，最后加入0.15ml10%过硫酰胺(AP)，0.006ml四甲基乙二胺(TEMED)。快速震荡混匀后倒入预先固定好的1.5mm玻板中，室温静置30min；(8)8%SDS－PAGE浓缩胶(2块)：取去离子水5.5ml，依次加入1.3ml30%丙烯酰胺，1.0mlTris-HCl(1.0M，pH6.8)，0.08ml10%SDS混匀，最后加入0.08ml10%过硫酰胺(AP)，0.008ml四甲基乙二胺(TEMED)。快速震荡混匀后倒入分离胶上方，立即插入孔梳，室温静置8min拔出孔梳；(8)电泳缓冲液(5×)：称取Tris碱30g，甘氨酸144g，SDS5g，以去离子水定容至1000ml作为储存液，室温储存。使用时按储存液:去离子水(1:4)稀释为工作液，-4℃保存；(9)电泳转移缓冲液(5×)：称取Tis碱30.3g，甘氨酸144.1g，以去离子水定容至1000ml作为储存液，室温储存。使用时按储存液:去离子水(1:4)稀释为工作液，-4℃保存；(10)BSA(3%)封闭液：称取BSA粉剂3g，加入预先配制的TBST(10×)溶液100ml，搅拌混匀后分装使用，-20℃保存；3.2.2实验方法3.2.2.1细胞培养与传代3.2.2.1.1HaCaT细胞的培养实验前，打开电热恒温水箱和超净工作台，启动风机，以含75%酒精的湿抹布擦拭台面，然后将实验所需物品置入并整理摆放好，点燃酒精灯置于台面中央。①在超净工作台内将4-5ml37℃复温的含体积分数为10%FBS和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液转移至灭菌培养瓶中备用；②HaCaT细胞取自本课题组细胞库，储存于液氮罐(-80℃)。使用前从液氮罐中取出HaCaT细胞冻存管后置37℃电热恒温水箱快速复温后转移至上述备好的灭菌培养瓶中；③然后将灭菌培养瓶置入细胞培养箱，在37℃，5%CO2和湿度95%条件下常29 陆军军医大学硕士学位论文规培养，24h后倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并进行常规换液。3.2.2.1.2HaCaT细胞的传代定期观察细胞生长情况，待细胞融合度达到80%-90%时传代。①取出灭菌培养瓶，吸尽原有培养液，无菌PBS清洗3次；②加入适量0.25%胰蛋白酶覆盖培养瓶底部，置入37℃培养箱中约5min后取出观察，当70%-80%细胞收缩变圆、细胞间空隙明显增大时加入含体积分数为10%FBS的RPMI1640培养液终止消化；③反复缓慢轻柔吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数板计数，或冻存或用于后续实验。3.2.2.2GO培养液的制备每次处理细胞前，先将浓度为2.0mg/ml的GO母液置超声水浴锅超声分散10min；然后以含体积分数为10%FBS和100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液稀释成不同终浓度，即0(Control)μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml和10.0μg/ml。3.2.2.3GO的物理表征3.2.2.3.1TEM检测GO的横向直径将超声预处理的GO溶液(50μg/ml)滴到铜网上，超净工作台内自然干燥后立即插入到透射电子显微镜进行测试，并拍照记录，加速电压为20kV。采用IPP6.0(Image-ProPlus，图像处理软件)处理分析所得图像。3.2.2.3.2AFM观察GO的形貌特征并测量其厚度将预处理GO溶液(50μg/ml)旋涂到单独的云母基板上，4000rpm,离心30s，然后45℃干燥3h。以AFM使用纳米级V控制器执行扫描探针进行检测。以NanoScopAnalysis软件处理所得数据。3.2.2.4GO对HaCaT细胞形态的影响①制备细胞悬液：取对数生长期HaCaT细胞，进行细胞计数，以常规细胞培养4液将细胞密度调整为2.0×10个/ml；②24孔细胞培养板，每孔加入1ml上述细胞悬液，将细胞培养板置于37℃和5%CO2的细胞培养箱常规培养；③培养24h后弃原培养液，PBS冲洗3次；④以随机数字表法分组，分别加入含终浓度为0μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml和10.0μg/ml的GO培养液常规培养；以0μg/ml组为空白对照组。30 陆军军医大学硕士学位论文⑤常规培养24h后使用倒置相差显微镜观察细胞形态变化并拍摄细胞照片记录。3.2.2.5GO对HaCaT细胞活性的影响①以2.2.4中方法调整细胞浓度，将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔加样量为100μl，并在最外圈培养孔中加入适量PBS，以减少培养板内培养液的蒸发，每组接种4个复孔，在37℃和5%CO2条件下的细胞培养箱常规培养24h；②培养24h后弃原培养液，PBS冲洗3次；③以随机数字表法分组，分别加入含终浓度为0μg/ml、0.001μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml和10.0μg/ml的GO培养液常规培养；以0μg/ml组为空白对照组；④于接种后24h、48h和72h更换为新的培养液，观察细胞状态，并于每孔加入10μlCCK-8溶液，在37℃，5%CO2条件下孵育反应2h；⑤孵育反应2h，吸取每培养孔内的上清液至新的96孔培养板中，在波长为450nm条件下使用酶标仪检测每孔OD值并记录之。3.2.2.6GO对HaCaT细胞迁移能力的影响5①以2.2.4中方法调整细胞浓度为10个/ml，并接种于24孔细胞培养板中，每孔加样量为1ml，每组接种4个复孔，置于37℃和5%CO2条件下的细胞培养箱常规培养；②待细胞贴壁生长良好，达到80%融合时，吸尽原培养液，PBS冲洗2次后采用含终浓度为4μg/ml丝裂霉素的常规细胞培养液，在37℃和5%CO2条件下孵育反应2h[65]；③孵育反应2h后，以规格为10μl无菌移液枪头于孔板底部中央处垂直划痕，弃原培养液，PBS冲洗3次；④采用随机数字表法分组，每组3个复孔，并分别加入含终浓度为0μg/ml、0.001μg/ml、0.1μg/ml和1.0μg/ml的GO培养液；以0μg/ml组为空白对照组；⑤将24孔细胞培养板移至活细胞工作站下进行观察，然后使用ImageJ软件测量划痕后0h(即刻)、6h、12h、24h划痕面积并记录之。⑥根据公式(1)，计算出细胞迁移率：(划痕0h划痕面积－其余各时相点划痕面积)细胞迁移率=×100%划痕0h划痕面积31 陆军军医大学硕士学位论文3.2.2.7GO对HaCaT细胞骨架的影响4以2.2.4中方法调整HaCaT细胞浓度为2×10个/ml，在24孔细胞培养板中预先放置无菌细胞爬片，将上述细胞悬液接种至24孔细胞培养板中细胞爬片上，每孔接种1ml，常规培养贴壁生长(约24h)换液，PBS冲洗2次后以随机数字表法分组，然后分别加入含终浓度为0μg/ml、0.001μg/ml、0.1μg/ml和1.0μg/ml的GO培养液。以0μg/ml组为空白对照组。每组设3个复孔。常规培养24小时后，对细胞骨架进行荧光染色，具体操作方法如下：①取出细胞培养板，吸尽原培养液，并以37℃复温的0.1MPBS轻柔冲洗3次，每次约5min；②37℃复温的4%多聚甲醛室温下固定30min；③0.1MPBS轻柔冲洗3次，每次约5min；④加入适量0.5％Triton-X100，使其能覆盖爬片，室温处理30min；⑤0.1MPBS轻柔冲洗3次，每次约5min；⑥以3%BSA溶液封闭，37℃，30min；⑦0.1MPBS轻柔冲洗3次，每次约5min；⑧加入预先配制的罗丹明-鬼比环肽(1:100)工作液进行细胞骨架染色，4℃，暗盒内染色2h；⑨0.1MPBS轻柔冲洗3次，每次约5min；⑩加入10μg/ml的DAPI溶液暗盒内复染细胞核5min；⑪取出细胞爬片至载玻片上，以抗荧光淬灭剂封片后，置免疫荧光共聚焦显微镜观察细胞骨架改变。3.2.2.8GO对HaCaT细胞PCNA、F-actin、Vinculin蛋白表达的影响6①目标蛋白的提取及定量：同2.2.4中方法调整HaCaT细胞浓度为10个/ml，接种于6孔细胞培养板，每孔接种1ml，常规培养，待细胞生长至80%融合时，PBS冲洗2次后以随机数字表法分组，然后分别加入含终浓度为0μg/ml、0.001μg/ml、0.1μg/ml和1.0μg/ml的GO培养液。以0μg/ml组为空白对照组。每组设3个复孔。常规培养24小时后提取细胞总蛋白质，具体操作方法如下：1)取出细胞培养板，吸尽原培养液，以0.1MPBS冲洗2次，用移液器吸尽PBS后于每孔加入200μl0.25%胰蛋白酶，消化约5分钟后于每孔加入1mlPBS，反复轻柔吹打，并用吸管将消化后的细胞悬液转移至1.5mlEP管中，800rpm，5min离心，弃上清液，每管中加入RIPA蛋白裂解液250μl，PMSF5μl，反复吹打混匀，剧烈震32 陆军军医大学硕士学位论文荡40s，置冰上消化10min，随后进行超声裂解细胞；2)低温高速离心(4℃，12000rpm)，30min；3)吸取上清液移至预冷的EP管，并做好标记，此为提取的总蛋白溶液。4)蛋白定量(BSA法进行蛋白定量)：a.取试剂盒中A液1000μl，并加入试剂盒中B液10μl，混匀后得到C液；b.标本的稀释及显色：取5μl蛋白样品，加入20μlLysisBuffer，随后再加入200μlC液，混匀后置37℃恒温水浴锅中30min；c.在562nm波长下使用酶标仪检测其OD值，即可得到蛋白浓度，所得数值乘以5得到样品原液浓度(μg/ml)；d.样品稀释：使用LoadingBuffer(6×)和蛋白裂解液将样品蛋白原液浓度稀释到2μg/ml，沸水中煮沸15min后分装，于-80℃冰箱保存，以免反复冻融。②SDS-PAGE凝胶电泳及显色：1)复温蛋白样品，并组装电泳仪；2)配制5%的分离胶和8%的浓缩胶；3)上样：按分组顺序用微量上样器于每个上样孔中加入20μg蛋白样品，两边孔内加入5μl预染蛋白Marker，并做好标记。注：每孔上样体积尽量相同，体积不足的以LoadingBuffer(1×)补充；4)电泳：先将直流电压设定为80V，待溴酚蓝燃料进入分离胶时(大约30min)，将电压调至100V，继续电泳，直至溴酚蓝燃料到达分离胶底部，耗时约2h；5)以甲醇浸泡PVDF膜(厚度0.22μm)10s后转至电转缓冲液中冲洗备用；6)取出凝胶夹板，电转缓冲液冲洗后切胶板轻轻翘起玻璃板，小心分开玻璃板和凝胶，并除去多余凝胶，随后将凝胶转至电转缓冲液中冲洗备用；7)按如下顺序组装电转夹板：黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板。注：组装前以电转缓冲液预先浸湿以上所有用品；组装时将平铺于凝胶上，以5ml移液管于凝胶上来回滚动，以保证驱除所有气泡，另外在胶-膜外再包的滤纸与膜之间也不能存在气泡，且要全程保证胶/膜湿润。8)内槽内倒入预冷的电转缓冲液，将电泳夹板放入电泳内槽，胶面向阴极，并灌满电转缓冲液以淹没胶；随后将上述电转装置放入装有冰水混合的保温盒中，黑板接负极，白板接正极，低温电泳，直流电压设为100V，时间设为90min；9)取出PVDF膜，TBST(1×)洗涤30s，然后置入含3%BSA的PBS溶液中封闭3h，随后根据目标蛋白分子量大小裁剪PVDF膜；33 陆军军医大学硕士学位论文10)孵育一抗：将PVDF膜置于湿盒的蜡板上，加入适量(以充分覆盖条带为好)配制好的一抗(PCNA，1:1000；F-actin，1:500；Vinculin，1:200；GDPDH，1:2000；�-actin，1:2000)，4℃过夜；11)取出湿盒，室温下静置1h，使用TBST(1×)漂洗条带5次，每次5min；12)孵育二抗：HPR-山羊抗兔IgG，1:2000，HPR-山羊抗鼠IgG，1:2000，室温条件下孵育1h；13)TBST(1×)漂洗条带5次，每次5min；14)辣根过氧化酶显色，并将条带依次放入凝胶成像仪中，调整位置和曝光参数，采集图像，以QuantityOne软件分析目的蛋白和内参蛋白灰度值并进行统计分析。3.2.3统计学分析处理及作图实验所得数据以±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两独立样本比较行样本t检验，多个样本中的两两比较行LSD检验(软件自动略去该统计量值)，组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05，以P值<0.05提示存在统计学意义上差异，P值>0.05提示无统计学意义差异。文中使用GraphpdaPrism6软件绘图。3.3实验结果3.3.1GO的物理特征图3.1A显示GO纳米片的透射电子显微镜图像，提示GO纳米片是一个二维，呈现为超薄的“不规则层片状结构”，横向直径约为10.0μm；图3.1B-C显示GO纳米片的原子力电子显微镜图像，提示GO纳米片的形貌特征；图3.1D是GO纳米片的厚度分析，提示其厚度约为1.0nm。以上数据提示本实验所使用GO纳米片呈形状不规则的单层片状结构，平均横向直径约为10.0μm。34 陆军军医大学硕士学位论文A：GO透射电子显微镜（TEM）观察；B、C：GO原子力电子显微镜（AFM）观察；D：GO厚度分析图3.1GO纳米片TEM和AFM观察3.3.2GO对HaCaT细胞增殖的影响3.3.2.1GO对HaCaT细胞形态的影响图3.2显示含不同浓度GO培养液处理细胞后倒置光学显微镜下细胞形态变化：提示低浓度(0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml)GO组处理细胞后与对照组(0μg/ml)对细胞形态无明显影响，细胞紧密粘附于基板上，并呈岛屿状聚集分布，而高浓度组(≥10.0μg/ml)细胞形态模糊，皱缩变形。GO处理24h后细胞形态观察：A：0μg/mL；B：0.001μg/mL；C：0.01μg/mL；D：0.1μg/mL；E：1.0μg/mL；F：10.0μg/mL；红色箭头示GO纳米片；标尺为100μm图3.2不同浓度GO培养液处理24h后HaCaT细胞形态观察（倒置相差显微镜）35 陆军军医大学硕士学位论文3.3.2.2GO对HaCaT细胞活性的影响利用CCK-8试剂盒检测不同浓度GO对细胞活性影响。如图3.3所示，在24h内，各浓度对细胞活性影响无统计学差异，但48h开始，高浓度组(1.0μg/ml、10.0μg/ml)即开始出现抑制细胞活性现象，且10.0μg/ml组较1.0μg/ml明显；另外随着培养周期延长，在处理72h后，0.1μg/ml组对细胞活性亦开始出现抑制现象。提示GO对HaCaT细胞活性的影响具有浓度和时间依赖性。ns:P>0.05，*:P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001；****:P<0.0001，与对照组（0μg/mL）比较图3.3GO处理24h后各组细胞OD(450nm)值变化(n＝4)3.3.2.3GO对HaCaT细胞PCNA蛋白表达的影响如图3.4所示，GO处理细胞24h后，0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL和1.0μg/mL浓度组PCNA表达情况与对照组（0μg/mL）无明显差异，10.0μg/mL组则明显低于对照组(P<0.05)。提示高浓度氧化石墨烯可以抑制细胞增殖。因此，随后实验采用对细胞活性和增殖均无明显影响的GO浓度进行，即0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL以及1.0μg/mL。36 陆军军医大学硕士学位论文A：WesternBlot检测各组PCNA蛋白表达；B：各组PCNA的相对灰度值(n＝3)；ns:P>0.05，*:P<0.05，与对照组（0μg/mL）比较图3.4GO处理24h后WesternBlot检测各组PCNA表达3.3.3GO对HaCaT细胞迁移的影响及初步机制探讨3.3.3.1GO对HaCaT细胞迁移的影响如表3.1、图3.5所示，划痕后0h、6h各GO浓度组迁移面积与对照组(0μg/ml)比较无统计学差异；划痕后12h、24h，0.01μg/ml组细胞迁移面积较对照组(0μg/ml)明显减小，在24h时，该组比对照组增加了35.33％(P<0.01)，而0.001μg/ml、0.1μg/ml组与对照组比较无统计学差异，1.0μg/ml比对照组大。划痕后各组对细胞迁移率的影响与迁移面积结果一致。故提示低浓度GO可促进HaCaT细胞的迁移，其中以0.01μg/mL浓度效果最明显。而当GO浓度高于0.1μg/mL时，尤其是浓度达到1.0μg/mL时，HaCaT细胞迁移受到明显抑制(P<0.01)。表3.1各浓度组不同时相点HaCaT细胞迁移率比较(%,±s)组别6h12h24h0μg/mL6.455±0.73820.316±0.67666.834±3.8990.001μg/mL7.010±2.04923.124±1.56672.444±7.0650.01μg/mL7.245±2.54530.281±2.94090.445±4.4160.1μg/mL6.414±2.23020.424±2.31562.446±2.2081.0μg/mL5.135±1.9699.315±0.86720.436±4.25337 陆军军医大学硕士学位论文A：各浓度组不同时间点HaCaT细胞划痕观察；B：划痕区愈合面积曲线(n＝3)；ns:P>0.05，**:P<0.01，***:P<0.001；****:P<0.0001，与对照组（0μg/mL）比较图3.5活细胞工作站下观察各组HaCaT细胞划痕愈合情况3.3.3.2GO对HaCaT细胞骨架的影响激光共聚焦显微镜观察发现(图3.6)，对照组(0μg/mL)及GO组（0.001μg/ml、0.1μg/mL、1.0μg/ml组）细胞纤毛稀少，胞内应力纤维束纤细，1.0μg/mL组最为显著，细胞明显变小、变圆，而0.01μg/mL组纤毛明显增多，胞内应力性纤维增粗。激光共聚焦显微镜观察GO对HaCaT细胞骨架的影响；白色箭头：细胞纤毛和胞内应力纤维；标尺：5μm图3.6不同浓度GO处理HaCaT细胞后细胞骨架的观察3.3.3.3GO对HaCaT细胞F-actin蛋白表达的影响WesternBlot检测F-actin的表达，结果显示(图3.7)0.01μg/mL组表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而1.0μg/mL组明显低于对照组（P<0.05）。38 陆军军医大学硕士学位论文A：Westernblot检测各组F-actin蛋白表达；B：各组F-actin表达的相对灰度值(n＝3)；*：P<0.05，与对照组（0μg/mL）比较图3.7不同浓度GO处理HaCaT细胞后F-actin蛋白的表达变化3.3.3.4GO对HaCaT细胞Vinculin蛋白表达的影响如图3.8所示，Vinculin表达水平随GO浓度升高而逐渐升高，但仅当GO浓度达到0.01μg/mL后才有统计学差异（P<0.01）。A：Westernblot检测各组Vinculin蛋白表达水平；B：各组Vinculin表达的相对灰度值(n=3)；ns:P>0.05，*:P<0.05，**:P<0.01，与对照组（0μg/mL）比较图3.8不同浓度GO处理HaCaT细胞后Vincunlin蛋白的表达变化3.4讨论皮肤作为人体最大器官，在维持机体内环境稳定和保障生命延续方面发挥重要作用，是机体与外界的一道天然屏障[1]。而各种原因所致的急慢性皮肤缺损，特别是大面积皮肤深度缺损(如重度、特重度烧伤)，很容易导致外界病原微生物的侵扰和机体内环境的紊乱，严重危害人类生命健康，并带来沉重的经济与社会负担。而通过各种手段快速有效地封闭创面是处理皮肤损伤的关键[2,3]。创面敷料可以重建皮肤屏障，39 陆军军医大学硕士学位论文加速创面愈合，同时可以作为临时皮肤替代物，为后期手术做好准备[66]。理想的创面敷料应该具备以下特性：优异的力学性能、适当的水蒸气透过率以及良好的生物相容性。更为重要的是，如何通过材料创新以及技术革新，使研制的创面敷料本身就具备一定生物学功能，是目前材料学家以及临床医生的考虑的重点和难点。我们前一部分实验发现以仿生GO-TPU多孔膜复合材料处理创面后其创面愈合率明显高于空白对照组。同时通过观察和测量创面新生上皮长度发现GO-TPU组创面新生上皮长度明显长于空白对照组。以上研究结果提示仿生GO-TPU多孔膜复合材料可以通过促进创面新生上皮生长而发挥促进创面愈合、缩短创面愈合时间的作用。结合课题组前期的研究成果，提示敷料的孔径结构和仿生特性在促进创面愈合和再上皮化方面发挥积极作用，其机制是可以通过促进创面细胞粘附、增殖以及创面血管生长来发挥促进创面愈合的作用[2，48]。另外是由于敷料的仿生学特性，上表面孔径小且稀少，从而可以阻挡外界病原微生物入侵，减少创面感染机会[61]，进而加速创面修复进程。但本次实验中我们还注意到含有GO的GO-TPU复合材料在促进小鼠创面愈合和新生上皮生长方面，效果要明显优于纯的TPU仿生多孔膜组。以上实验显示GO可能在加速创面愈合过程中发挥积极作用。然而GO在复合材料到底发挥怎么样的作用，是GO本身可以影响创面周围组织及细胞的生物行为还是引入GO后对复合材料其它性能改变？其作用机制又是什么呢？因此我们选择人永生化表皮细胞株-HaCaT细胞为研究模型，探讨了GO在皮肤创面愈合中的作用及潜在机制。石墨烯由于独特的理化性质以及良好的生物相容性，而被广泛应用于工业等领域。氧化石墨烯作为石墨烯最重要的衍生物之一，由于其表面的各种含氧基团，如羟基、羰基、羧基和环氧基等[9,10]，使其具备更良好的水溶性及稳定性，且利于经一步化学修饰，使其在生物医学领域可能比不溶于水的石墨烯具有更大的应用潜力。根据以往研究发现，氧化石墨烯的氧化程度、含氧基团分布情况以及纳米片的表面形貌、厚度和横向直径等会影响其生物学性能，也会影响实验结果[67-70]。比如有学者[67]研究通过对比含不同氧化基团以及厚度的氧化石墨烯对细胞活性的影响，发现低氧化程度的一组在处理72h后其EC50是45.5μg/ml，而高氧化程度则为2.9μg/ml，且单层氧化石墨烯显现更轻微的细胞毒性。Akhavan等[70]发现大尺寸(3.8±0.4)μmGO纳米片比小尺寸的细胞毒性小，且同尺寸的氧化石墨烯要比还原型氧化石墨烯细胞毒性小。而我们利用AFM和TEM方法对GO进行物理表征，数据显示GO纳米片呈单层不规则片状结构，平均横向直径为10μm，结合既往研究，提示本实验选用的GO对细胞形态和毒性影响可能不大。此外，AFM和TEM图像可以看出GO非常稳定且均匀地40 陆军军医大学硕士学位论文分散在水中，这可能是得益于GO表面极性官能团和水分子之间形成的氢键所致。细胞活性及增殖能力是细胞参与生物学活动的基础。目前有文献报道提示氧化石墨烯具有调控细胞行为的潜能，且就有浓度和时间依赖性。Hu等[71]利用电镜观察到GO可以通过内作用吞进入哺乳动物A549细胞内，而且细胞活性随GO浓度增加及培养时间延长略有下降。另有学者发现低浓度GO不会对A549细胞产生明显毒性，但高浓度GO会造成细胞内环境紊乱，并诱导产生ROS，引导氧化应激，而影响细胞活性[72]。但Zhang等[73]人发现GO即使在低浓度时(20μg/ml)也很产生明显细胞毒性，并且随浓度升高而逐渐增强。我们通过显微镜观察不同浓度GO对细胞形态的影响，发现浓度低于10.0μg/ml时对细胞无明显影响，但当浓度达到10.0μg/ml时，细胞形态逐渐模糊，并发生皱缩、变形（图3.2）。通过CCK-8试剂盒检测细胞活性(图3.3)，发现GO处理24h后对照组和GO组细胞活性无明显差异；但随培养周期延长，在刺激48h后，浓度高的两组(1.0、10.0μg/ml)最先出现毒性(P<0.01)，且10.0μg/ml组比1.0μg/ml组更明显，提示高浓度更具有更强的细胞毒性；在刺激72h后，0.1μg/ml组亦开始出现细胞毒性，提示GO毒性具有时间依赖性。随后，PCNA作为反映细胞增殖状态的良好指标，我们利用WesternBlot检测了PCNA的表达情况(图3.4)，发现低浓度对细胞增殖无明显作用，高浓度(>1.0μg/ml)组则会抑制细胞的增殖。这些结果与已有研究“石墨烯和氧化石墨烯对小鼠NIH-3T3细胞或者U87、U118细胞有很弱的细胞毒性和抑制增殖效应”一致[74,75]。但与报道出现毒性和抗增殖效应的培养周期和浓度不同，我们分析可能是因为微米级的GO要比纳米级GO毒性小[76]，也可能是由于GO制备和体外实验中使用的细胞类型不同所致[68,72]。因此，根据GO物理表征及对细胞活性和增殖性能检测，提示我们选用的GO在一定浓度和时间范围内对HaCaT细胞活性和增殖影响小，因此我们进一步研究了GO对细胞迁移行为的影响。创面再上皮化依赖于表皮细胞由创周等向创面中心迁移。因此表皮细胞的迁移被认为是创面愈合的核心和关键[29,30]。以往有文献报道GO可以调控细胞的迁移行为。比如Mukherjee等[77]报道低浓度(10～100ng/ml)的氧化石墨烯可以通过提高活性氧表达促进细胞迁移。Jiang等[78]报道3D石墨烯支架可以通过改变细胞骨架、提高粘着斑蛋白等表达促进神经干细胞迁移。我们通过传统划痕实验检测GO对细胞迁移的影响。如图3.5和表3.1显示，低浓度GO可以促进HaCaT细胞迁移，其中以0.01μg/ml浓度效果最明显。因此本研究证实横向直径为10μm左右的GO可以促进表皮细胞迁移。细胞骨架系统是细胞内以蛋白纤维为主体成分构成的网络结构，主要由微管、微41 陆军军医大学硕士学位论文丝以及中间丝三类蛋白纤丝构成，其在维持细胞形态、内部结构以及细胞迁移、胞内物质运输、细胞分化等一系列细胞行为活动中发挥重要作用。而以进化上高度保守的肌动蛋白组成的螺旋状，且具有极性的微丝则被认为是影响细胞运动的主要动力系统，其中肌动蛋白的重组装及动态结构改变在细胞迁移中发挥至关重要的作用[78-80]。微丝的聚合与解聚是一个动态过程，胞浆内存在许多种可与肌动蛋白结合的蛋白质，并参与上述过程的调节，比如Thymosin能抑制肌动蛋白聚合形成微丝，从而影响细胞伪足等结构形成，进而阻碍细胞运动[79]。另外Vinculin蛋白作为一种高度保守的细胞内蛋白，是细胞表面的黏附位点，对外与E-钙粘蛋白或整合素等相连形成胞外粘着斑，对内则通过Talin蛋白与微丝骨架相连，将微丝锚定在胞膜上，从而在维持、调节细胞粘附和迁移行为中发挥重要作用[78,81,82]。Chandrasekar等[83]发现Vinculin可通过与PIP2相关作用引起粘着斑解聚，同时Vinculin与微丝也发生解离，从而促进细胞运动。还有许多研究发现在恶性肿瘤细胞中，Vinculin表达下降，从而导致细胞黏附力下降，促进癌变细胞移行，降低细胞刚性，以更易于肿瘤细胞在组织中的穿行[84]。但也有研究表明Vinculin表达升高后可以通过增加粘着斑的面积和数量，从而抑制细胞迁移[81]。以上研究提示Vinculin在细胞迁移过程中发挥双重作用，一方面可以通过介导粘着斑的形成和解离，以及微丝与细胞膜的连接来促进细胞迁移；另一方面可以通过增加粘着斑的面积和数量来抑制细胞运动。因此我们利用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架的变化以及免疫印迹法检测相关蛋白表达初步探讨了GO影响细胞迁移的潜在机制。图3.6显示了GO处理后HaCaT细胞的鬼比环肽染色，通过共聚焦显微镜我们发现0.01μg/mlGO组细胞周围的丝状伪足、片状伪足明显增多，胞内应力纤维束增粗，而Control组(0μg/ml)以及0.001μg/ml、0.1μg/mlGO组细胞纤毛稀少，胞内未见明显纤维束，1.0μg/mlGO组细胞则变小、变圆，通过WesternBlot检测发现0.01μg/mlGO组细胞骨架蛋白(F-actin)表达均高于其他各组，而1.0μg/ml组显著降低(图3.7)，提示与激光共聚焦显示细胞骨架结果一致。Vinculin蛋白表达(图3.8)0.01μg/mlGO组高于Control(0μg/ml)、0.001μg/ml组，但1.0μg/ml组表达最高，提示粘着斑蛋白表达升高可以促进细胞迁移，但过度表达可能导致细胞粘附增加而降低其迁移。因此，不同浓度GO处理后导致细胞骨架重排、形态变化以及细胞粘附能力的不同则进一步解释本研究中观察到的不同的细胞迁移行为。总而言之，我们通过体外实验探讨了GO对皮肤创面愈合的影响及潜在机制。发现在低浓度GO不会影响细胞的活性与增殖行为，但随着浓度的升高和培养周期延长，GO对细胞的毒性及抑制细胞增殖的能力逐渐增强。进一步研究发现，一定浓度的GO42 陆军军医大学硕士学位论文可以促进细胞迁移，其潜在机制可能是通过影响细胞骨架重排和F-actin、Vinculin等细胞运动相关蛋白的表达。但细胞迁移是一个极其复杂且需要精细调控的过程，激光共聚焦等手段只能捕捉到细胞在接受到信号分子刺激后一些相应的改变，如肌动蛋白向细胞边缘聚集，微丝微管增多，纤毛数量的增多等，从而使细胞边缘或胞质内的荧光信号增强，但要具体解释氧化石墨烯不同尺寸、作用时间等对实验结果的影响以及作用于细胞迁移行为的分子信号通路等具体机制，还需要进一步的研究。43 陆军军医大学硕士学位论文全文结论在本研究中，我们采用粒滤-湿法工艺成功将GO引入到TPU支架中，制备了具有仿生结构的GO-TPU多孔膜复合材料，并通过建立小鼠全层皮肤缺损模型，观察和评估了仿生GO-TPU多孔膜对皮肤创面修复的影响；另外为了明确GO在复合材料促进创面愈合过程中发挥的作用及机制，我们通过体外实验，选择人永生化表皮细胞株-HaCaT细胞为研究对象，研究了GO对细胞行为的影响，并初步探讨其可能机制。现综合全文总结如下：1.GO在TPU多孔膜中能促进全层皮肤创面创面愈合。我们利用粒滤-湿法工艺成功制备了具有模拟正常皮肤构造特性的GO-TPU多孔膜复合材料。将GO-TPU膜与单纯TPU膜应用于小鼠全层皮肤缺损创面，在术后第7天发现创面愈合率由单纯TPU膜组的81.70%提高到GO-TPU膜组的87.97%，新生上皮长度由单纯组的831.46μm增至1307.11μm。提示GO可通过促进皮肤创面新生上皮形成，最终促进创面愈合。2.GO对HaCaT细胞活性和增殖的影响具有时间和浓度依赖性。本研究显示GO处理细胞24h后，各浓度组对细胞形态、活性无明显影响，但10.0μg/mlGO组会显著抑制细胞的增殖；在处理48h后，1.0μg/ml、10.0μg/mlGO组最先出现抑制细胞活性现象，且10.0μg/ml组较1.0μg/ml更明显，提示随GO浓度升高，其抑制细胞活性作用逐渐增强；另外随培养周期延长到达72h后，0.1μg/ml组也出现抑制细胞活性现象，提示GO抑制细胞活性具有时间依赖性。3.合适浓度的GO可促进HaCaT细胞迁移。本研究通过传统划痕实验发现低浓度GO可促进HaCaT细胞的迁移，其中以0.01μg/mL浓度效果最明显。在处理划痕后24h，该组细胞迁移面积比对照组增加了35.33%。而当GO浓度高于0.1μg/mL时，尤其是浓度达到1.0μg/mL时，HaCaT细胞迁移受到明显抑制。4.GO可通过改变HaCaT细胞骨架重排以及迁移相关蛋白表达来影响细胞迁移。通过鬼比环肽染色并利用激光共聚焦显微镜观察发现，对照组(0μg/mL)及经0.001μg/ml、0.1μg/mlGO处理的细胞纤毛稀少，胞内应力纤维束纤细，高浓度组(1.0μg/ml)最为显著，细胞明显变小、变圆，而0.01μg/ml组纤毛明显增多，胞内应力性纤维增粗。WesternBlot检测F-actin的表达，结果显示0.01μg/mL组表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而1.0μg/mL组明显低于对照组；检测Vinculin表达水平提示随44 陆军军医大学硕士学位论文GO浓度升高而逐渐升高。综上，本课题通过研究GO-TPU多孔膜对小鼠皮肤创面愈合的影响，发现GO在复合材料促进创面愈合过程中发挥积极作用；另外，我们选择人表皮细胞株-HaCaT细胞为研究模型，通过体外实验研究了GO对细胞行为的影响，发现其可能通过改变细胞骨架重排以及细胞运动相关蛋白表达来促进细胞迁移。这为未来GO在新型促创面愈合敷料以及临时皮肤替代物的研制和开发提供了新的设计思路和理论依据，值得GO相关组织工程材料研究借鉴，但其在复合材料中所发挥怎样的作用，以及具体作用机制是什么仍有待进一步的研究来进行阐述解释。45 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陆军军医大学硕士学位论文文献综述氧化石墨烯生物医学应用的研究进展摘要氧化石墨烯（GO）是石墨烯的一种衍生物，拥有较高的比表面积以及丰富的含氧官能团，从而使其具备良好的亲水性、分散性以及生物相容性，并且易于进行修饰以及功能化，再加上良好的光学性质，使得氧化石墨烯在生物医学领域拥有巨大的运用潜能。本文对氧化石墨烯在生物医学各领域研究现状进行分析，介绍了氧化石墨烯在药物及基因传递、生物成像、肿瘤治疗、抗菌抗炎方面的研究进展及其生物安全性。关键词：氧化石墨烯；药物及蛋白质传递；生物成像；肿瘤治疗；抗菌抗炎；生物安全性；研究进展Advancesinthebiomedicalapplicationsofgrapheneoxide[Abstract]GrapheneOxide(GO)isaderivativeofgraphene,withhigherratioofsurfaceareaandabundantfunctionalgroups,whichmakeitpossessadispersionofhydrophilicity,andgoodbiocompatibility,andisalsoeasytobemodifiedandfunctional,andithasagoodopticalproperty,sothatgrapheneoxideinthebiomedicalfieldhasagreatapplicationpotential.Inthispaper,theresearchstatusofgrapheneoxideinvariousbiomedicalfieldsisanalyzed,andtheresearchprogressandbiologicalsafetyofgrapheneoxideindrugandgenedelivery,biologicalimaging,tumortherapy,antibacterialandanti-inflammatoryareintroduced.Keywords:grapheneoxide;drugandproteintransmission;bio-imaging;tumortherapy;antibacterialandanti-inflammatory;biosafety;researchprogress石墨烯是由碳原子构成的一种二维原子晶体，是一种具有单层原子厚度的蜂巢网53 陆军军医大学硕士学位论文状结构新型纳米材料，其基本结构单位为苯六元环。石墨烯具有良好的导电性能、优异的透光性以及较高的机械强度，此外还可以促进组织再生以及优良生物相容性和抗菌性能等，在生物医学方面具有着广阔的应用潜能[1]。作为石墨烯最重要的衍生物之一，氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）是使用天然石墨制备而成的一种单层纳米材料，由石墨烯经强酸氧化后而成，与石墨烯具有基本相同的结构。但和石墨烯相比较，由于表面富含含氧官能团，氧化石墨烯的亲水性能更强，同时能够提供更大的比表面积，并具有更强的表面活性；此外，氧化石墨烯易于修饰以及功能化，并拥有良好的光学性能，在生物医学领域的多个方面均具有较好的应用前景和优势[2,3]。本文从生物医学多方面分析目前氧化石墨烯的应用研究进展。1氧化石墨烯在药物及基因传递方面的应用在过去的十年时间里，以纳米粒子为基础的药物输送系统已经被研究应用于癌症治疗当中，主要目的在于改善抗肿瘤疗效同时减少化疗药物的毒副作用。近年来，多项研究开始探索运用石墨烯等作为基础的药物输送系统。由于石墨烯或氧化石墨烯具有较高的比表面积，材料的双面均可用于载药，因此其药物负载量较高；此外，经共价键修饰后的石墨烯可连接靶向材料，从而实现对于特定类型肿瘤细胞选择性药物的输送[4]。Liu[5]课题组于首次报道了使用聚乙二醇修饰的氧化石墨烯作为水难溶性芳香类的抗癌药物-喜树碱衍生物SN38的输送载体，研究结果显示修饰后的氧化石墨烯在生理溶液中稳定性良好，可通过pH响应性释放装载的抗肿瘤药物，从而有助于抗肿瘤药物治疗效果的大大提升。此后，多项研究报道了石墨烯pH响应性的抗肿瘤药物输送载体[6,7]。随后学者还报道了给予石墨烯热响应性抗肿瘤药物的输送载体，使得石墨烯作为药物输送载体的应用进一步扩大[8，9]。WeaverCL等[10]人研究报道了一种由电控制的药物释放系统，将氧化石墨烯置于导电聚合物支架上，然后使用这种复合材料负载地塞米松。研究结果显示，该系统表现出了良好的电学性能，可通过感应电刺激释放药物，且改变电刺激幅度可调整药物的释放剂量。随着对氧化石墨烯研究的不断深入，学者发现氧化石墨烯除了可作为药物载体外，还可将其用作为基因载体。研究表明[11]，GO-CS可与质粒DNA之间形成相对稳定的纳米复合物，从而转染至Hela细胞上，可有效提高转染效率。Chen等人[12]将PEI（聚乙烯亚胺）接枝到氧化石墨烯上，并发现该系统具有极佳的DNA传递能力。虽然目前多项研究均证实氧化石墨烯经过适当的表面修饰后可作为细胞水平的基因转染载体，但是对于氧化石墨烯在体内细胞转染还需要进一步的研究和开发。因此为实现54 陆军军医大学硕士学位论文氧化石墨烯在体内细胞转染的目的，对氧化石墨烯进行良好、巧妙的表面修饰仍是必不可少的研究工作之一。2氧化石墨烯在生物成像中的应用由于氧化石墨烯固有的物理性质，特别是其光学性能，不仅可将其运用于肿瘤的光热治疗以及药物载体、基因输送中，还可将其运用于生物医学成像方面。Sun[13]课题组首次利用nGO-PEG在近红外区进行荧光细胞成像，并发现nGO-PEG从可见光区到近红外区均有一定荧光，提示该体系可用于细胞成像，而且呈现低背景。同时在细胞成像研究中，有学者将抗CD-20的抗体（利妥昔单抗）共价连接到nGO-PEG，进行B细胞特异性标记，在658nm激光激发下检测1100-2200nm范围内nGO-PEG的IR-A荧光进行细胞成像，并发现淋巴B细胞显示出很强的荧光信号，而对照组的CCRF-CEMT细胞则显示出很弱的荧光信号[14]。由于氧化石墨烯容易受到生物组织的干扰，从而限制了其在动物活体成像方面的运用。Yang[15]课题组使用近红外染料Gy-7标记GO-PEG，然后将标记后的GO-PEG注射到不同肿瘤模型小鼠体内进行荧光成像，结果显示，小鼠肿瘤组织内可显示出很强的荧光信号，表明GO-PEG具有着一定的肿瘤被动靶向作用。光学成像作为近年来发展起来的一种成像模式，氧化石墨烯在光学成像方面也表现出一定的运用潜能。Sheng[16]课题组研制了一套光学/超声双模式成像系统，结果显示，还原氧化石墨烯光声成像信号与浓度之间具有明显的线性关系。随后课题组对肿瘤模型动物进行活体成像实验，将修饰后的还原氧化石墨烯注射到MCF-7荷瘤鼠体内，进而利用上述成像系统进行活体成像，即首先利用超声确认肿瘤位置，然后再使用光学成像系统比较注射氧化石墨烯前后荷瘤鼠体内肿瘤组织光声信号变化情况，结果显示，注射前肿瘤区域光声信号非常微弱，而注射后该区域信号则出现明显增强。3氧化石墨烯在肿瘤治疗方面的应用目前在肿瘤的治疗方面，化疗以及放疗是除手术外最主要的两种治疗方式，但放化疗往往会导致机体正常组织器官的损伤，因此在肿瘤治疗方面，寻找新型的抗肿瘤疗法，提高疗效同时降低副作用一直是研究者关注的焦点话题[17]。近年来提出的光学疗法，包括光热治疗（PTT）以及光动力治疗（PDT），是一种新型的抗肿瘤治疗方式，可以通过特定的光照射发挥抗肿瘤作用[18]。氧化石墨烯由于其优异的光学特性，因此以氧化石墨烯为基础的光学疗法获得了学者的关注。光热疗法指的是在光吸收剂作用下，使肿瘤组织吸收特定波长的照射激光，从而在组织局部产生高温而杀死肿瘤细胞[19]。氧化石墨烯以及还原氧化石墨烯在近红外区域有着较强的光吸收能力，因55 陆军军医大学硕士学位论文此在肿瘤光热治疗方面潜能巨大。Yang[15]课题组将还原GO-PEG注射到肿瘤模型小鼠体内，使用近红外激光对小鼠肿瘤部位进行照射，结果显示，小鼠肿瘤组织出现明显消退，且小鼠生存期有明显延长。此外，氧化石墨烯作为一种高效纳米载体，对光敏剂具有着良好的负载作用，因此可将其用于癌症的光动力治疗。学者利用甲氧基聚乙二醇修饰氧化石墨烯，负载光敏剂酞菁锌，其负载率可达到14%，被MCF-7肿瘤细胞内化后，使用氙灯照射可表现出对肿瘤细胞明显的光动力学杀伤毒性[20]。4氧化石墨烯抗菌作用Hu等学者首次报道了氧化石墨烯具有抗菌特性，并推测该抗菌特性主要可能来源于机械破坏或氧化损伤[21]。研究发现氧化石墨烯可以对细菌体内的还原型谷胱甘肽进行氧化作用，因此认为氧化石墨烯的抗菌性除了对细胞膜的机械性物理破坏之外，还可能诱发细菌发生氧化损伤[22]。学者分别使用金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌对沉积在不锈钢基质上的氧化石墨烯纳米墙的抗菌性能进行分析，发现氧化石墨烯对两种细菌均有良好的抗菌性能[23]。Liu[24]课题组分析了氧化石墨烯对大肠杆菌活力的影响，结果显示，氧化石墨烯的抗菌性与其尺寸大小呈正相关，大尺寸氧化石墨烯抗菌性能较小尺寸更佳。此外，学者使用原子力显微镜观察发现，氧化石墨烯可以对大肠埃希氏菌进行有效包裹，从而阻断大肠埃希氏菌与周围环境之间的关联，进而造成细胞活性的丧失[24,25]。而这一包裹机制使得氧化石墨烯作为一种过滤介质而用于清除润滑油、燃料等有机溶剂中的细菌成为可能。尽管目前氧化石墨烯自身的抗菌性能仍存在一定的争议，但是氧化石墨烯作为一种基底材料与其他预设化合物或抗菌金属纳米颗粒形成纳米复合物的抗菌活性是确实被研究者所公认的。最常见的是一种纳米抗菌复合物为与银纳米颗粒所形成的Ag-GO纳米复合物，银纳米颗粒作为一种被人们所熟知的纳米抗菌物质，结果显示与单纯的银纳米颗粒比较，Ag-GO具有着更为理想的抗菌活性[26]。其机制可能是由于GO具有很大的表面积，从而有助于银颗粒与细菌的接触；GO阻止了银颗粒自身发生团聚，从而有助于其高效的发挥抗菌作用；GO与银离子之间可能存在协同抗菌活性[27]。5生物安全性氧化石墨烯在生物医学领域具有着巨大的运用前景，但是与此同时，其生物安全性也是学者关注的焦点之一，这直接关系到氧化石墨烯是否能够安全有效的投入实际使用。学者研究氧化石墨烯对A549细胞形态、活性的影响来分析氧化石墨烯的生物毒性，结果显示，氧化石墨烯并未进入A549细胞内部，且对A549细胞未表现出明显56 陆军军医大学硕士学位论文的毒性，但是在高浓度下，仍可对细胞造成轻微的损伤，表明氧化石墨烯的细胞毒性与其剂量有关[28]。但是Zhang等研究发现[29]，即使低浓度的氧化石墨烯对Hela细胞也会产生明显的毒性，且其毒性随着氧化石墨烯浓度的增加而增强。此外，学者[30]将氧化石墨烯通过尾静脉注射至小鼠体内，同样显示其生物毒性呈明显的剂量依赖性，并且发现氧化石墨烯主要在小鼠肺部发生沉积，可引起小鼠发生肺内肉芽肿，严重者可引起小鼠死亡。除此之外，Qiao等人[31]研究分析了氧化石墨烯对细胞DNA复制的感染及介导突变能力，结果显示，1μg/ml氧化石墨烯可完全阻断人磷酸甘油醛脱氢酶基因的复制。此外，学者研究认为，氧化石墨烯官能团密度及其尺寸均对其细胞毒性造成影响，使用某些大分子物质，如聚合物等对氧化石墨烯进行有效的化学修饰，可在很大程度上减少氧化石墨烯的生物毒性，从而使其实际运用成为可能[32]。6总结与展望近年来，氧化石墨烯受到了研究者广泛关注，本文对氧化石墨烯在生物医学领域的应用研究进行综述。由于氧化石墨烯良好的生物相容性、巨大的比面积、优良的光学性质以及大量的活性位点易于功能化，是一种前景广阔的生物医用纳米材料。但是在实际应用中，氧化石墨烯仍然面临诸多困难和挑战，主要是氧化石墨烯在实际应用中的生物毒性问题，还需要研究者进行不断探索和研究。但是作为一种非凡的新型纳米材料，氧化石墨烯必将在生物医学领域发挥举足轻重的作用。57 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陆军军医大学硕士学位论文致谢行文至此，意味着三年的硕士学习生涯即将谢幕，望眼满纸文字，内心百感交集，欲说还休。初时的梦想，拥有的快乐以及历经的磨练最终都在这淡然一笑中，化为漫漫人生旅途中的一段过往。三年时光，宛如片片秋叶，也在不知不觉中悄然而逝，其中充满了苦辣酸甜，但心中更多的仍是感恩还有感激。在这段人生经历中，对我影响最为深远的便是我的导师罗高兴教授，非常感谢您在我学习和生活中给以的指导和无私关怀。您严谨求实的治学态度，大胆求新的科研思维以及严以律己的人格魅力在给我树立成功榜样的同时，也已成为我未来奋斗的目标和准则。在我心中，您是严厉而又实在的，但回想这三年求学生活，如果没有您的鞭策和教导，我肯定跌更多的跟头，走更多的弯路，谢谢您让我重新认识自己，改正自己的缺点，最后超越自己，同时感谢您在我迷茫时的点拨和指引，是您让我逐渐懂得什么是科研，怎样做科研，不管以后我还有没有从事的机会，但我一定会更加努力，承担起属于自己的责任，并时刻准备着，不忘初心，勇往直前，以报答您的谆谆教诲。在此，我衷心祝愿恩师您绿水青山春常驻，桃李芬芳满天涯。同时还要感谢吴军教授、贺伟峰研究员在课题设计阶段的悉心指导，以及实验室陈希伟、胡晓红、张小容、王颖、周新等实验室老师在课题实施阶段给以的诸多帮助，感谢您们这几年的支持与信任，在此表示衷心的感谢和崇高的敬意，祝您们在未来的生活工作中身体安康，家庭幸福。感谢彭毅志教授、袁志强副教授以及宋华培副教授、向飞博士、谭江琳博士、周俊峄博士、陶利菊副主任护师等在我临床学习期间对我的帮助和指导，祝您们工作顺心，万事如意。感谢四川大学高分子材料学与工程研究院的夏和生教授以及蒋瑶珮硕士在课题设计和实施阶段给以的诸多指导和帮助，愿我们的友谊永驻，课题合作芝麻开花节节高。感谢郑银、施高强、王杨平、刘腾飞等一起奋斗的战友们，以及课题组詹日兴博士后、李海胜博士、钱卫博士、王淞博士、周代君博士、李雅舒博士、刘梦龙博士、雷强硕士、于洵洲硕士、朱海杰硕士、刘勉硕士等所有兄弟姐妹与我一道分享青春成长的快乐，也正是你们才构成了我学习生活一个完整的故事，才会让我如此留恋与你们在一起的时光，期待还会再见。此外还要特别感谢见证我成长的父母和家人，感谢他们一如既往的支持和关怀，62 陆军军医大学硕士学位论文是他们让我更加乐观地面对生活中的一切，成为我坚持奋斗的不竭动力。他们是最爱我的人，同时也是我亏欠最多的人，我将用尽我的一生去回报。最后感谢我的爱人聂卉，千里来渝，陪我一起完成学业。最后，我要向百忙之中参与审阅、评议本论文以及参与本人论文答辩的各位老师表示衷心的感谢！正因为有你们的帮助和关心，我的人生才更加美好幸福，我定会更加努力，不忘初心，砥砺前行，我想只有这样才是我能给你们最好的回报吧。最后的最后，感谢我的母校，谢谢您为人生成长最重要的阶段提供的这一方乐土。谢谢！！！63