双酚a引起父源性生殖缺陷的小鼠模型建立与机制研究

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1、双酚A引起父源性生殖缺陷的小鼠模型建立与机制研究EstablishmentofamousemodelofpaternalreproductivedefectsexposedtobisphenolAanditsmechanisms作者姓名：李玉华专业名称：病理学与病理生理学研究方向：生殖病理生理学指导教师：李扬教授李润生研究员学位类别：医学博士培养单位：吉林大学基础医学院论文答辩日期：2015年6月1日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：祝世功教授北京大学医学部主席：李玉林教授吉林大学吴珊教授吉林大学委员：金宁一教授中国人民解放军军

2、事李晓萌教授东北师范大学医学科学院张咸宁教授浙江大学刘强教授大连医科大学张丽莙教授天津医科大学王恩华教授中国医科大学王丽颖教授吉林大学中文摘要双酚A引起父源性生殖缺陷的小鼠模型建立与机制研究研究背景：目前普遍认为，约有70%的出生缺陷是由环境因素与遗传因素共同作用的结果。由于胚胎发育对外界环境特别敏感，因而母源性因素对胚胎发育的影响一直是研究出生缺陷的主要角度。而对于父源性出生缺陷的研究却没有给予应有的重视。随着社会经济的发展，环境污染、不良生活习惯等各种环境因素使人类精液质量不断下降，而精液质量的持续下降很有可能提高父系出生缺陷的发生率。双

3、酚A（BPA）是一种人类普遍暴露的环境内分泌干扰物。据报道能对动物体和人体的神经系统、免疫系统、内分泌系统、生殖系统等产生不良影响。双酚A可通过多种机制作用于多种靶器官发挥生物学效应。BPA除了能够结合经典的雌激素受体ERα和ERβ，还能通过G蛋白偶联的膜雌激素受体GPR30的非基因组途径迅速发挥作用；此外，BPA的作用还涉及表观遗传学机制。高剂量的双酚A对雄性生殖系统有害，特别是在组织器官形成和发育阶段的暴露能对实验动物造成生殖功能的危害，并且可以持续到成年期；低剂量BPA对雄性生殖系统的危害还存在着争议。BPA对子代生殖功能的影响目前也没

4、有明确的结论，双酚A对精子的表观遗传修饰作用如DNA甲基化，组蛋白甲基化等的影响及其在传代中的意义都是有待研究的科学问题。研究目的：建立BPA引起精子异常而导致F1子代雄性生殖出生缺陷的小鼠模型，揭示BPA暴露小鼠精子的表观遗传学特征，初步揭示BPA引起精子异常与子代生殖缺陷的表观遗传学基础。方法：首先建立BPA雄性小鼠的暴露和传代模型。高剂量BPA以50mg/kg/day的剂量腹腔注射3周龄雄性C57BL/6J小鼠7天，5周后取样及繁殖，与6周龄正常雌性小鼠繁殖产生F1代，F1代雄性小鼠再与正常雌性小鼠繁殖产生F2代。检测F0、F1、F2代

5、雄鼠精子数量、精子形态和睾丸组织形态学。抽提F0代小鼠精子DNA，MeDIPI富集甲基化DNA后进行高通量测序及生物信息学分析，建立BPA暴露的小鼠精子DNA甲基化谱，并挑选差异甲基化基因和印记基因进行验证。分离F1代小鼠的精原细胞进行mRNA表达谱芯片检测和生物信息学分析，建立BPA暴露的F1代小鼠精原细胞表达谱。进行甲基化谱与表达谱的负相关分析。通过定量PCR技术、Westernblot、免疫组化等技术，检测BPA对DNA甲基化转移酶mRNA水平、组蛋白甲基化水平的影响。低剂量BPA暴露分别以5μg/kg/day、50μg/kg/day的

6、剂量灌胃给药3周龄C57BL/6J雄性小鼠5周，与6周龄正常雌性小鼠繁殖产生F1代。利用DNA甲基化结合蛋白MBD方法富集小鼠精子甲基化DNA，结合荧光定量PCR方法检测Tnnt2、Tectb等基因甲基化水平的相对变化；Westernblot检测F1代小鼠精子中组蛋白甲基化水平变化。利用小鼠精原干细胞C18-4细胞，体外研究BPA对小鼠精原干细胞增殖及表观遗传机制的影响。结果：1、高剂量BPA暴露对雄性小鼠及其子代的生精功能有不良影响。高剂量BPA引起F0代小鼠精子数量下降20.6%（P<0.01），F1代小鼠精子数量下降12.1%（P<0.

7、05），F2代小鼠精子数下降9.2%（P>0.01）。高剂量BPA暴露引起F0代小鼠精子畸形率增加了9.65%（P<0.05），对F1、F2代小鼠精子畸形率没有明显影响（P>0.05）。高剂量BPA暴露能引起F1代出生性别比增加（P<0.05）。2、F0代精子甲基化DNA高通量测序共筛选出1597个差异基因，其中BPA引起的低甲基化基因有1112个，占69.6%；高甲基化基因有379个，占23.7%；106个基因部分低甲基化，部分高甲基化。经进一步验证，F0代BPA组小鼠精子中印记基因Gtl2、H19、Igf2r、Kcnq1、Gnas、Imp

8、act、Lit1、Nespas、Mest、Peg3、Peg10、Snrpn甲基化水平与对照组没有统计学差异（P>0.05）；BPA组小鼠精子中Magef1基因启动子