参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织erk通路的影响及作用机制研究

《参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织erk通路的影响及作用机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

单位代码：10369学号：20120052：2015届顿士研究生学位论文参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究GINSENGANDASTRAGALUSHYPOGLYCEMICGRANULEONEARLYDIABETICNEPHROPATHYRATSKIDNEYTISSUESTHEEFFECTOFERKPATHWAYANDMECHANISMOFACTIONRESEARCH学科专业：_________中医内科学____________研究方向:中医药防治糖尿病及其并发症导师：董昌武教撈_______硕士生：____________杨才顺论文完成单位•.安徽中医药大学_________2015年5月•合肥 密级：学号：201200522015届硕士研究生学位论文参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究GINSENGANDASTRAGALUSHYPOGLYCEMICGRANULEONEARLYDIABETICNEPHROPATHYRATSKIDNEYTISSUESTHEEFFECTOFERKPATHWAYANDMECHANISMOFACTIONRESEARCH作者姓名杨才顺申请学位级别硕士指导教师姓名董昌武职称教授学科专业中医内科学研究方向中医药防治糖尿病及其并发症学习时间自2012年9月1日起至2015年7月1日止论文提交日期2015年3月1日论文答辩日期2015年5月27日学位授予单位安徽中医药大学学位类型科学学位 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是木人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由木人承担。学位论文版权使用授权书本人完全了解安徽中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密(请在以上方框内打“V”）学位论文作者（需亲笔）签名 目录中文摘要……………………………………………………………1ABSTRACT………………………………………………………...3英文缩略词表………………………………………………………7正文1.前言………………………………………………………….……82.材料与方法………………………………………………...……102.1主要药物…………………………………………….…...……102.2主要试剂与仪器………………………………………………102.3动物模型的建立及分组……………………………….…...…102.4药物与给药剂量………………………………………..…..…112.5标本采集与处理………………………………………..…..…112.6检测指标与方法……………………………………….…..…122.7统计学处理………………………………………..……….…153.结果………………………………………………………..……164.讨论………………………………………………………..……245.结论…………………………………………………………..…326.问题与展望…………………………………………………..…337.参考文献…………………………………………………..……34综述1……………………………………………………...….…37综述2……………………………………………………...….…43附录 研究路线图………………………………………………...….….49攻读学位期间发表论文情况…………………………………..…50致谢…………………………………………………………..……51作者简介……………………………………………………..……52 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究中文摘要目的:研究参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK信号转导通路的影响及对肾脏的保护作用，探讨ERK信号转导通路在早期糖尿病肾病发生发展中的作用与地位，探讨参芪降糖颗粒防治糖尿病肾病的作用机制，为临床合理用药提供实验依据。方法:选用SD雄性大鼠为实验动物，随机分出正常对照组（简称正常组）和糖尿病肾病造模组。造模组大鼠左侧肾脏切除，１周后高予以糖高脂喂养４周，再单次腹腔注射小剂量链脲佐菌素制备糖尿病肾病模型。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病肾病模型组(简称模型组)、中药参芪降糖颗粒干预组(简称参芪组)和PD98059阳性对照组(简称PD98059组)，分组后各组开始给予相应的干预。干预8周后检测各组大鼠尿微量白蛋白排泄率(UAER)、尿肌酐、空腹血糖、糖化血红蛋白（GHb）、血肌酐；ELISA法检测血清中的纤维连接蛋白（FN）含量；测定24h尿量、并计算内生肌酐清除率（CCr）,肾重/体重；HE染色方法观察各组肾组织病理形态；免疫组化法检测各组肾脏组织ERK信号通转导路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达。结果:1、在血糖值方面：与正常组相比，模型组和PD98059组均显著升高（P＜0.01），参芪组与正常组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，参芪组和PD98059组均显著降低（P＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组明显低于PD98059组（P＜0.01）。2、在GHb值方面：与正常组相比，参芪组、模型组与PD98059组均显著增高（P值均＜0.01）；与模型组相比，参芪组与PD98059组均显著降低（P值均＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组显著低于PD98059组（P＜0.01）。3、在血清FN值方面：与正常组相比，模型组明显升高（P＜0.05），参芪组、PD98059组与正常组相比均无显著差异（P值均＞0.05）；与模型组相比，参芪组、PD98059组显著降低（P值均＜0.01）；而与PD98059相比，参芪1 中文摘要组与之差异无统计学意义（P＞0.05）。4、在UAER值方面：与正常组相比，模型组显著升高（P＜0.01），PD98059组亦明显升高（P＜0.05），而参芪组与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，PD98059组与参芪组显著降低（P值均＜0.01），而PD98059组与参芪组之间相比差异无统计学意义（P＞0.05）。5、在肾重/体重百分值方面：与正常组相比，模型组、PD98059组、参芪组均显著增大（P均＜0.01）；与模型组相比，参芪组明显低于模型组（P＝0.01），而PD98059组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与PD98059组相比，参芪组与之无统计学差异（P＞0.05）。6、在CCr水平方面：各组之间两两比较均无显著性差异（P值均＞0.05）。7、在24h尿量方面：与正常组相比，模型组、PD98059组均显著大于正常组（P＜0.01），参芪组与正常组之间相比无明显差异（P＞0.05）；与模型组相比，参芪组明显小于模型组（P＜0.05），PD98059组与模型组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与PD98059组相比，参芪组显著减少（P＜0.01），8、在血肌酐、尿肌酐浓度方面：各组之间两两比较均未得出有意义的结论。9、HE染色光镜下可见正常组大鼠肾组织结构正常；模型组大鼠大部分肾小球见系膜基质轻度结节样增生，部分肾小球表伴见散在系膜细胞增生；参芪组和PD98059组大鼠肾组织病理变化均较模型组轻，仅见局灶肾小球系膜基质增生，部分肾小球见节段性增生；参芪组和PD98059组大鼠相比较，肾小球系膜增生变化无明显差异。各组大鼠肾组织均未见肾小球硬化表现。10、免疫组化检测各组大鼠肾皮质组织ERK信号转导通路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达检测结果显示：正常组大鼠肾组织无ERK、p-ERK及MKP-1蛋白表达，其余各组大鼠肾小球及肾小管细胞均有表达。与模型组相比，参芪组和PD98059组的表达明显减轻；参芪组和PD98059组之间的比较则无明显差异。结论:参芪降糖颗粒能通过降低血糖、GHb、血清FN、减少尿蛋白、抑制肾脏组织ERK信号通路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1表达，从而抑制肾小球系膜增生，抑制肾小球纤维化，保护肾功能，防治糖尿病肾病的发生发展。关键词：糖尿病肾病；益气养阴；参芪降糖颗粒；ERK通路；动物实验2 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究ABSTRACTObjective:StudyginsengandastragalushypoglycemicgranuleonearlydiabeticnephropathyratskidneytissuestheeffectofERKsignaltransductionpathwayandprotectiontothekidneysandexploretheERKsignaltransductionpathwayinpositionanditsroleinthedevelopmentofearlydiabeticnephropathy,ginsengandastragalushypoglycemicgranulepreventionmechanismofdiabeticnephropathy,providetheexperimentalbasisforclinicalrationaldruguse.Methods:ChooseSDmaleratsasexperimentalanimals,randomcentgivesthenormalcontrolgroup(normalgroup)anddiabeticnephropathymodule(tobuildmodelratsleftnephrectomyafter1week,highsugarandhighfatfeedfor4weeks,one-timeintraperitonealinjectionofureawithsmalldoseofchainrhzomorphreplicationmodelofdiabeticnephropathy).Buildingsuccessfulratswererandomlydividedintodiabeticnephropathymodel(modelgroup),Chinesemedicineginsengandastragalushypoglycemicgranuleinterventiongroup(hereinafterreferredtoasginsengandastragalusgroup)andPD98059positivecontrolgroup(hereinafterreferredtoasPD98059group),eachgroupgivecorrespondingintervention.Interventionin8weeksaftertestingeachraturinetracealbuminexcretionrate(UAER)andurinecreatinine(available),fastingglucose,glycosylatedhemoglobin,serumcreatinine.ELISAmethodtodetectfiberconnectionsintheserumprotein(FN)content;24hurinewasmeasured,andcalculatetheendogenouscreatinineclearancerate(CCr),kidneyweight/bodyweight;HEdyeingmethodtoobserveeachkidneypathologicalform;ImmunohistochemicalmethodtodetectgroupsofERKproteininvolvedinkidneytissueERKsignaltransductionroad,theexpressionofp-ERKandMKP1.Results:3 ABSTRACT1,intheaspectofbloodsugarlevels:comparedwithnormalgroup,modelgroupandPD98059groupweresignificantlyhigher(P<0.01),therewasnostatisticallysignificantdifferencebetweenginsengandastragalusgroupandnormalgroup(P>0.05);Comparedwithmodelgroup,ginsengandastragalusgroupandPD98059groupweresignificantlylower(P<0.01);ComparedwithPD98059group,ginsengandastragalusgroupwaslowerthanthatingroupPD98059(P<0.01).2,intermsofavailablevalues:comparedwithnormalgroup,ginsengandastragalusgroup,modelgroupandPD98059groupweresignificantlyincreased(P<0.01);Comparedwithmodelgroup,ginsengandastragalusgroupandPD98059groupweresignificantlylower(P<0.01);ComparedwithPD98059group,ginsengandastragalusgroupsignificantlylowerthanthatofPD98059group(P<0.01).3,intermsofvalueofserumFN:comparedwithnormalgroup,modelgroupincreasedsignificantly(P<0.05),ginsengandastragalus,PD98059grouphadnosignificantdifferencecomparedwithnormalgroup(P>0.05);Comparedwithmodelgroup,ginsengandastragalusgroup,PD98059significantlyreduced(P<0.01);AndcomparedwithPD98059,ginsengandastragalusgroupandthedifferencesofnostatisticalsignificance(P>0.05).4,intermsofUAERvalue:comparedwithnormalgroup,modelgroupsignificantlyincreased(P<0.01),PD98059alsoincreasedsignificantly(P<0.05),whiletheginsengandastragalusgrouptherewasnostatisticallysignificantdifferencecomparedwithnormalgroup(P>0.05);Comparedwithmodelgroup,PD98059andginsengandastragalusgroupdecreasedsignificantly(P<0.01),andcomparedbetweenPD98059andginsengandastragalusgrouptherewasnostatisticallysignificantdifference(P>0.05).5,thekidneyweight/bodyweightpercentile:comparedwithnormalgroup,modelgroup,PD98059,ginsengandastragalusgroupweresignificantlyincreased(P<0.01);Groupcomparedwithmodelgroup,ginsengandastragaluswaslowerthanthatinmodelgroup(P=0.01),whilePD98059groupcomparedwithmodelgrouptherewasnostatisticallysignificantdifference(P>0.05);ComparedwithPD98059group,ginsengandastragalusgroupwithnostatisticaldifference(P>0.05).6,intermsoflevelofCCr:bothtwocomparisontherewasno4 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究significantdifferencebetweengroups(P>0.05).7,inthe24hurine:comparedwithnormalgroup,modelgroup,PD98059groupweresignificantlygreaterthanthenormalgroup(P<0.01),comparedwithnosignificantdifferencebetweenginsengandastragalusgroupandnormalgroup(P>0.05);Comparedwithmodelgroup,ginsengandastragalusgroupsignificantlylessthanthemodelgroup(P<0.05),therewasnostatisticallysignificantdifferencebetweenPD98059groupandmodelgroup(P>0.05);ComparedwithPD98059group,ginsengandastragalusgroupsignificantlydecreased(P<0.01),8,inserumcreatinine,uriccreatinineconcentrationareas:bothtwocomparisonbetweengroupswasnotmeaningfulconclusions.9andHEstainingwerevisibleundernormalgroupofnormalratkidneystructure;Mostofmodelgrouprats,seeglomerularmesangialmatrixmildnodularhyperplasia,partoftheglomerulusseetablewithscatteredinmesangialcellproliferation;GinsengandastragalusgroupandtheratkidneypathologicalchangesofPD98059groupwerecomparedwithmodelgrouplight,onlyfocalhyperplasiaofglomerularmesangialmatrix,someseeglomerularsegmentalhyperplasia;GinsengandastragalusgroupandPD98059groupratscomparedwithglomerularmesangialproliferationchangehasnoobviousdifference.Eachratkidneyglomerularsclerosiswasnotfound.10,immunohistochemicaldetectionofeachratrenalcorticaltissueERKproteininvolvedinERKsignaltransductionpathway,theexpressionofp-ERKandMKP1testresultsshowedthatnormalratkidneytissueswithoutERK,p-ERKproteinexpressionandMKP-1,therestofthegroupratsglomerulusandrenaltubulecellswereexpressed.Comparedwithmodelgroup,theexpressionofginsengandastragalusgroupandPD98059significantlyreduce;GinsengandastragalusgroupandthecomparisonbetweenPD98059group,nosignificantdifferences.Conclusion:Ginsengandastragalushypoglycemicgranulecanreducebloodsugar,availablethrough,serumFN,reduceurinaryprotein,inhibitionofERKproteininvolvedinkidneytissueERKsignalingpathways,p-ERKandMKP1expression,thusinhibitingglomerularmesangialproliferation,inhibitglomerularfibrosis,protectrenal5 ABSTRACTfunction,preventionandtreatmentofdiabeticnephropathydevelopment.Keywords:diabeticnephropathy;QiandnourishingYin;Ginsengandastragalushypoglycemicgranule;ERKpathway.Experimentsonanimals6 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究英文缩略词表英文简称英文全称中文全称ACEIAngiotensinconvertingenzymeinhibitor血管紧张素转换酶抑制剂AngIAngiotensinI血管紧张素IAngIIAngiotensinII血管紧张素IIARBsAngiotensinreceptorblockers血管紧张素受体拮抗剂AGEsAdvancedglycosylationendproducts糖基化终末产物CCrTheendogenouscreatinineclearance内生肌酐清除率CTGFConnectivetissuegrowthfactor结缔组织生长因子DMDiabetesMellitus糖尿病DNDiabeticNephropathy糖尿病肾病ECMExtracellularmatrix细胞外基质ELISAEnzymeLinkedImmunoSorbentAssay酶联免疫吸附剂测定ESRDEnd-stagerenaldisease终末期肾病ERKExtraCellularSignalregulatedProteinKinase细胞外信号调节蛋白激酶FNFibronection血清纤维连接蛋白GHbGlycatedhemoglobin糖化血红蛋白hs-CRPHypersensitivec-reactiveprotein超敏C反应蛋白IRInsulinresistance胰岛素抵抗LSDLeastSighnificantDifference最小显著差算法MAPKMitogen-ActivatedProteinkinase丝裂原活化蛋白激酶MDAMalondialdehyde丙二醛ODOpticalDensity吸光度SCrSerumcreatinine血肌酐STZStreptozotocln链脲佐菌素UAERUrinaryalbuminexcretionrate尿白蛋白排泄率7 前言1.前言糖尿病肾病(DiabeticNephropathy，DN)是糖尿病(DiabetesMellitus，DM)的严重并发症之一，随着DM发病率的逐年上升，DN已成为人民健康的重要威胁之一。DN的发病机制复杂，治疗的重点在于早发现，早治疗，延缓DN的发展[1]。近年来国内外对DN的防治做了大量研究探索，主要涉及：有关炎症信号转导通路在DN发生发展中的地位和作用，如NF-кB信号转导通路、酪氨酸激酶/转录因子(JAK/STAT)信号转导通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族相关信号通路等是研究的热点，尤其ERK信号转导通路已成为近年来防治DN机制研究的重点、热点[2]；治疗早期DN新型药物及新疗法的研究；中医中药对早期DN的治疗作用等等。研究认为血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACEI）和血管紧张素受体拮抗剂（Angiotensinreceptorblockers，ARBs）有降尿蛋白、保护肾功能的效果，但是随着DN发展，该类药物应用即受到限制；基因治疗可能是DN潜在的治疗途径之一，但与临床应用尚有一段距离；细胞外信号调节蛋白激酶（ExtraCellularSignalregulatedProteinKinase，ERK）通路ERK1/2抑制剂2-氨基-4-异氧黄铜（PD98059）能减轻肾小球基底膜的破坏，延缓DN的进程，但是仍处于实验阶段。DM属于祖国医学“消渴”范畴，中医认为气阴两虚是DN的基本病机，是DN发生发展的最根本条件，并始终贯穿于整个病程[3]。益气养阴是DN最基本的治疗法则。大量临床及实验研究证明益气养阴中药参芪降糖颗粒在防治DN时发挥了多靶点、多途径的作用，显示出了较好的疗效，但是DN气阴两虚的病机与ERK信号转导通路之间是否具有相关性？基于益气养阴法而确立的参芪降糖颗粒对DN发生发展的关键环节---ERK通路的作用确切机制如何？参芪降糖颗粒是否能够阻断ERK信号通路、抑制DN肾小球肥大、阻止肾小球基底膜增厚及系膜增生？有关这方面的研究尚未见报道。本课题基于前期良好研究基础及DN气阴两虚病机理论，结合近年来细胞内信号传递研究热点，以ERK信号转导通路与细胞生长、增殖、分化关系为切入点，参照高苹[4]建立的方法，模拟人类2型DM并发肾脏病变发病特点复制出8 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究DN大鼠模型，通过观察研究参芪降糖颗粒对早期DN大鼠尿微量白蛋白、血尿肌酐、肌酐清除率、血清纤维连接蛋白（Fibronection，FN）、血糖、糖化血红蛋白（Glycatedhemoglobin，GHb）、肾/体重比、24h尿量的影响及肾组织病理形态学变化和肾组织中ERK信号通路蛋白p-ERK、ERK及MKP-1的表达，探讨ERK信号转导通路在早期DN发生发展中的作用与地位，探讨参芪降糖颗粒防治DN的多靶点、多途径作用的相关作用机制；揭示参芪降糖颗粒对于DN肾组织ERK信号通路的影响及作用机制；为临床合理用药提供实验依据。9 材料与方法2.材料与方法2.1药物参芪降糖颗粒（鲁南厚普制药有限公司生产，国药准字Z10950075，生产批号00113305）；PD98059由美国Sigma公司生产（批号：20140305217）；水合氯醛：临用时配成10%的水合氯醛溶液。2.2主要试剂与仪器链脲佐菌素（Streptozotocln，STZ）由美国Sigma公司生产(批号：20140305440)；强生稳豪倍优型血糖仪、强生稳豪型血糖试纸（美国强生公司中国上海生产，注册证号：国食药监械（进）字2010第2401197号，生产批号：2013-8-1)；糖化血红蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A056)；尿微量白蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：C035-2，)；葡萄糖测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A038)；肌酐测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：C011-1)；大鼠纤维连接蛋白酶联免疫分析试剂盒（由安徽欣乐生物技术有限公司分装进口，批号：E-30657）；免疫组化用抗体ERK1/2(L352)(BIOWORLD公司，批号：CJ36131)、p-ERK1/2(Y204)(BIOWORLD公司，批号：CJ36131)、MKP-1(BIOSS公司，批号：20140723)、通用型二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K1356261）、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K137726A）。2.3动物模型的建立及分组选用7周龄健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只(安徽省实验动物中心提供，动物合格证号:scxk(皖)2011-002)，体重(230±20)g，适应性饲养1周后，随机分出正常对照组（简称正常组）10只，给予普通饲料喂养。其余60只造模，参照高苹[4]建立的方法，用10%的水合氯醛按0.35ml/100g大鼠腹腔注射，大鼠麻醉充分后，俯位固定，局部剃毛，消毒后背部切开找到左肾，沿肾蒂部位结扎并摘除左侧肾脏，5万单位青霉素腹腔注射后逐层缝合。术后分笼放置，待大鼠苏醒后先以5%葡萄糖盐水喂食，观察12-24小时，渐渐过渡到普通饲料喂养。左侧肾脏切除1周后，改换成高糖高脂饲料（即普通饲料中加入10%猪油、2.5%胆固醇、20%蔗糖精制而成）喂养4周后，禁食不禁水12h，用小剂量STZ10 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究30mg/kg体重（临用时以Ph4.2的0.1mmol/L枸橼酸缓冲液配成2%STZ溶液，并将容器置于冰块上，以保持STZ溶液的稳定性）单次腹腔注射，复制DM模型。腹腔注射STZ溶液后，观察2-3小时，大鼠若无异常反应，即可恢复饮食。72小时后测尾静脉血糖值≥16.7mmol/L，且尿量和饮水量明显增多者为DM造模成功。除了正常组外，将DM造模成功后的模型大鼠52只（另外8只大鼠手术过程中死亡2只，术后死亡4只，注射STZ后血糖不达标2只）继续恢复普通饲料喂养并随机分为早期DN模型组（简称模型组）18只、中药参芪降糖颗粒干预组（简称参芪组）17只、PD98059阳性对照组（简称PD98059组）17只。各组大鼠实验期间按组分笼饲养，勤换垫料、清洁饲养笼，保持饲养笼干燥和清洁通风，使大鼠自由进食、饮水，食物及饮水充足，防止缺水，防治感染，防止相互厮杀，并持续给予相应药物治疗干预，不使用任何胰岛素及其他降糖药物。药物干预8周后终止干预，大鼠禁食8h后集中处死。2.4药物与给药剂量参芪组大鼠从DM模型成模0日开始给予益气养阴中药参芪降糖颗粒1.0g/kg/d灌胃（将参芪降糖颗粒用纯净水配制成浓度为0.125g/ml,再根据大鼠的体重灌注不同量的参芪降糖颗粒溶液，参芪降糖颗粒剂量按60kg成人9.0g/d折算，相当于60kg成人日用量的7倍），每天灌胃一次，治疗观察8周[5]；PD98059阳性对照组于DM模型成模0日及以后每隔2周按0.3mg/kg给予尾静脉注射PD98059[6]，共4次，PD98059事先严格按照药物说明书用特殊溶媒溶解，并严格按照说明书规定的剂量使用；正常组、模型组均每日一次按体重给予等量生理盐水灌胃。2.5标本采集与处理尿标本留取：处死前一天大鼠禁食不禁水24小时，用代谢笼留取大鼠24小时尿液，接尿的容器内事先加入少量10%甲醛溶液防腐，测量24小时尿量并记录数值，取2ml尿液置于离心管中，2000rpm离心10分钟，离去沉渣,取上清液适量，置于小离心管中，存放于-80℃冰箱保存，待检测尿微量白蛋白和尿肌酐。血液标本留取：将大鼠称重，以10%水合氯醛0.35ml/100g腹腔注射麻醉。待麻醉充分后，将大鼠固定于解剖台上，从腹部正中开口，暴露腹主动脉，以11 材料与方法静脉采血针穿刺进入腹主动脉采血，血液标本于室温放置2小时后3000rmp离心15分钟，分离血浆置于小离心管中，待测。肾组织标本留取：在大鼠腹主动脉取血后，将手术切口向下延伸，暴露右侧肾脏。用冰生理盐水冲洗肾脏，取出右侧肾脏，称重，快速切取部分肾上极皮质后浸入10%甲醛中备用，HE染色方法用于光镜观察各组肾组织病理形态；免疫组化法检测各组肾组织ERK信号转导通路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达。2.6检测指标与方法2.6.1一般指标及生化指标检测处死前测体重、处死后测右肾重、计算肾重/体重比，检测空腹血糖，GHb，血肌酐，血清FN。血糖：葡萄糖氧化酶法；血肌酐、尿肌酐：按照肌酐测定试剂盒说明书操作测定，苦味酸比色法，并计算内生肌酐清除率(Theendogenouscreatinineclearance,CCr)：肌酐清除率公式：[尿肌酐浓度(μmol/L)*24小时尿量(ml)]/[血肌酐浓度(μmol/L)*24*60*体重(kg)]。尿微量白蛋白定量：CCB法，严格按照尿微量白蛋白测定试剂盒说明书测定，并计算UAER。GHb测定：严格按照GHb测定试剂盒说明书进行操作,用UV-754型紫外分光光度计测定OD值,结果以每10g血红蛋白中GHb的吸光度值表示。血清FN：酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测，标本于室温放置2小时后3000rmp离心15分钟，取上清待测。按试剂盒步骤操作，用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值），以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。2.6.2病理检查大鼠右肾组织固定后以石蜡包埋，切片，HE染色后400倍光镜观察。12 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究HE染色:石蜡切片脱蜡、水化→苏木素染色15min→自来水冲洗→1%盐酸乙醇分化数秒→自来水冲洗→Scotte浸泡数秒→自来水冲洗→1%伊红乙醇染色→95%乙醇和无水乙醇脱水→透明→待干、封片。HE染色具体操作步骤如下：（1）取切片，脱蜡至水：二甲苯1（15min）→二甲苯2（15min）→100%酒精（5min）→100%酒精（2min）→90%酒精（2min）→80%酒精（2min）→70%酒精（2min）→蒸馏水洗（2min）。（2）苏木精染色15min，将细胞核染成蓝色。自来水洗去浮色。染色液配制：苏木精2g100%酒精250ml硫酸铝17.6g双蒸水750ml碘酸钠0.2g冰醋酸20ml配制方法：将苏木精溶于100%酒精，摇匀。将硫酸铝捣碎，加双蒸水使其溶解。将苏木精酒精液与硫酸铝水溶液混合，立即加入碘酸钠，并搅拌，最后加20ml冰醋酸。（3）分色数秒。（4）蓝化自来水冲洗15-20min左右。（5）复制伊红染色2min左右，将细胞质染成红色。染色液配制：复制伊红0.5g双蒸水5ml冰醋酸数滴配制方法将伊红溶解于双蒸水5ml后，滴加冰醋酸原液10滴，加双蒸水10ml。再加冰醋酸原液8滴，产生沉淀后，再加双蒸水4ml。过滤，弃去上清液，保留沉淀物，烤干。用沉淀物加入90%酒精100ml即可使用。（6）分色95%酒精分色1min，镜下控制。（7）脱水95%酒精（5min）→100%酒精I（10min）→100%酒精II（10min）。13 材料与方法（8）透明二甲苯1（10min）→二甲苯2（10min）。（9）封片用中性树胶进行封片，显微镜下观察。（10）结果细胞核染成蓝色，细胞质染成红色。2.6.3免疫组化检查免疫组化法检测肾皮质ERK信号转导通路相关蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达采用免疫组织化学两步法PV-6000检测。脱腊、水化组织切片，3%H2O2去离子水，阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，滴加通用性二抗、DAB显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。其中抗ERK、p-ERK及MKP-1蛋白抗体工作浓度为1：100。阴性对照用PBS代替抗上述抗体。抗原采用微波修复。显微镜下观察、拍照，阳性部位呈棕黄色。免疫组化具体操作步骤如下：(1)过3道二甲苯，每道10min。(2)过3道95%乙醇，每道3min。(3)将切片连同染色架一起放入烧杯中，自来水流水缓慢冲洗，洗去酒精，直到切片干净透明。(4)抗原微波修复。在切片冲水的时候取另一烧杯，倒入约500ml柠檬酸，放入微波炉中加热至沸腾（约高火4min），再将切片连同染色架放入烧杯中，再放入微波炉，98度保持15min。(5)将烧杯放入冰水中冷却，直到柠檬酸冷却为止。(6)将孵育盒中稍微装一点水，将切片一张一张拿出来，用免疫组化笔画一个圈圈住组织，放在孵育盒上。(7)在组织上滴加3%H2O2，室温孵育8min。(8)PBS冲洗3遍。(9)将切片甩干，加一抗，盖上孵育盒盖子，37度孵育90min。(10)PBS冲3遍。(11)将片子甩干，加二抗，盖上孵育盒盖子，37度孵育30min。(12)PBS冲3遍。(13)甩干，加显色剂，约1min就可终止显色。(14)终止显色。事先准备一个烧杯，加入约500ml自来水，放入染色架，14 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究显色后即可将切片放入自来水中终止显色。(15)将烧杯放在自来水下流水缓慢冲洗，冲洗掉DAB,冲洗要充分，时间约10min。(16)衬染。冲洗充分后将染色架拿起，沥干水，放入蒸馏水中过一下，拿起沥干，苏木素染色3min，自来水冲洗干净。(17)分化。放入1%HCL中过一下即可，这时组织由蓝色变为红色。(18)自来水冲洗。(19)蓝化。放入50度的温水中几分钟，直到组织变蓝。(20)自来水冲洗。(21)过3道无水乙醇，每道3min，苯酚-二甲苯3min，3道二甲苯，每道3min。(22)中性树胶封片。2.7统计学处理—所有计量数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析处理。各组别间的两两比较采用最小显著差算法（LeastSighnificantDifference，LSD法）分析。以P<0.05为有统计学意义。15 结果3.结果3.1一般情况造模前所有大鼠毛发光泽，活泼敏捷，摄食正常，饮水正常，尿量正常。DM造模成功后大鼠血糖明显升高，并出现多饮、多尿、多食，毛色无光泽，易死亡。8周观察结束时，因同饲养笼内大鼠相互撕咬、感染、灌胃损伤或出现合并症等，各组大鼠有不同程度死亡。其中正常组大鼠死于灌胃损伤1只、死因不明1只，共死亡2只；模型组大鼠死于腹腔感染5只、死于尾部及尿路感染各1只、死于灌胃损伤1只、死于撕咬2只，共死亡10只；参芪组大鼠死于腹腔感染4只、死于灌胃损伤1只、死于尾部感染1只、死于撕咬1只、死因不明1只，共死亡8只；PD98059组大鼠死于腹腔感染5只、死于尾部感染1只、死于灌胃损伤1只、死于撕咬2只，共死亡9只。最终各组大鼠剩余只数为：正常组8只，模型组8只，参芪组9只，PD98059组8只。3.2各组大鼠空腹血糖、GHb、血清FN比较（见表1）—表1各组大鼠空腹血糖、GHb、血清FN比较(x±s)—Table1groupratsfastingglucose,available,comparisonofserumFN(x±s)组别只数空腹血糖GHb血清FN（n）(mmol/L)(OD/10gHb)(ug/L)正常组84.93±0.7420.18±2.3228.79±11.67模型组825.38±9.11*41.27±3.26*44.05±8.53▲PD98059组821.42±7.19*■37.39±1.73*■21.34±11.34■参芪组98.99±2.96■☆25.88±1.35*■☆28.12±13.02■注：与正常组比较，*P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较，■P<0.01；与阳性对照药物☆（PD98059）比较，P<0.01。16 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究图1各组大鼠空腹血糖值(mmol/L)（均值）Fig1Groupsofratsfastingglucosevalues(mmol/L)（themean）经过统计学分析发现，在空腹血糖值方面：与正常组相比，模型组和PD98059组均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，参芪组和PD98059组均显著降低（P＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组明显低于PD98059组（P＜0.01）。图2各组大鼠糖化血红蛋白值(OD/10gHb)（均值）Fig2groupsofglycatedhemoglobinvaluesinrats(OD/10gHb)（themean）17 结果经过统计学分析发现，在糖化血红蛋白数值方面：与正常组相比，参芪组、模型组与PD98059组均显著增高（P值均＜0.01）；与模型组相比，参芪组与PD98059组均显著降低（P值均＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组显著低于PD98059组（P＜0.01）。图3各组大鼠血清FN值(ug/L)（均值）Fig3groupsofratsserumFNvalues(ug/L)（themean）经过统计学分析发现，在血清FN值方面：与正常组相比，模型组明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，参芪组、PD98059组显著降低（P值均＜0.01）。3.3各组大鼠肾重/体重、UAER、24h尿量比较（见表2）—表2各组大鼠肾重/体重、UAER、24h尿量比较(X±S)Table2groupsofratkidneyweight/bodyweight,UAER,24hurineoutput—(X±S)组别只数肾重/体重UAER24h尿量（n）(%)(mg/24h)（ml）正常组80.29±0.0521.27±2.5815.75±2.38模型组80.68±0.12*68.78±27.38*28.00±9.99*PD98059组80.59±0.09*41.75±22.66▲■29.75±10.85*参芪组90.54±0.14*■35.16±6.33■18.63±5.24△☆注：与正常组比较，*P<0.01，▲P<0.05；与模型组比较，■P<0.01，△P<0.05；与阳性对照药☆物（PD98059）比较，P<0.01。18 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究图4各组大鼠肾重/体重(%)（均值）Fig4groupsofratskidneyweight/bodyweight(%)（themean）经过统计学分析发现，在肾脏指数方面：与正常组相比，模型组、PD98059组、参芪组均显著增大（P均＜0.01）；与模型组相比，参芪组明显低于模型组（P＝0.01）。图5各组大鼠UAER值(mg/24h)（均值）Fig5groupsofUAERofrats(mg/24h)（themean）经过统计学分析发现，在UAER值方面：与正常组相比，模型组显著升高（P＜0.01），PD98059组亦明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，PD98059组与参芪组显著降低（P值均＜0.01）。19 结果图6各组大鼠24h尿量值（ml）（均值）Fig6groupsofrats24hurinequantityvalue(ml)（themean）经过统计学分析发现，在24h尿量值方面：与正常组相比，模型组、PD98059组均显著大于正常组（P＜0.01）；与模型组相比，参芪组明显小于模型组（P＜0.05）；与PD98059组相比，参芪组显著减少（P＜0.01）。3.4各组大鼠内生肌酐清除率、血肌酐、尿肌酐比较（见表3）—表3各组大鼠内生肌酐清除率、血肌酐、尿肌酐比较(X±S)Table3groupsofratswithendogenouscreatinineclearancerate,serum—creatinine,uriccreatininecomparison(X±S)组别只数CCr血肌酐尿肌酐（n）(ml/min*kg)(μmol/L)(μmol/L)正常组82.23±0.5569.82±15.025825.28±1374.56模型组82.33±0.6290.87±26.063954.86±1575.16▲PD98059组82.11±0.7784.47±26.382935.90±1327.30*▲☆参芪组91.75±0.5798.06±26.454927.29±1454.04注：与正常组比较，*P<0.01,▲P<0.05；；与模型组比较，各组之间无显著差异；与阳☆性对照药物（PD98059）比较，P＝0.01。20 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究图7各组大鼠血肌酐值(μmol/L)（均值）Fig7groupsofratsserumcreatininevalues(μmol/L)（themean）经过统计学分析发现，在血肌酐值方面：与正常组相比，参芪组明显升高（P＜0.05）。图8各组大鼠尿肌酐值(μmol/L)（均值）Fig8groupsofraturinecreatininevalues(μmol/L)（themean）经过统计学分析发现，在尿肌酐值方面：与正常组相比，PD98059组显著降低（P＜0.01），模型组明显降低（P＜0.05）；与PD98059组相比，参芪组明显增高（P＝0.01）。21 结果图9各组大鼠CCr值(ml/min*kg)（均值）Fig9groupsofCCrvalueinrats(ml/min*kg)（themean）经过统计学分析发现，在CCr值方面：正常组、参芪组、模型组、PD98059组四组之间两两比较均无显著性差异（P值均＞0.05）。3.5肾组织病理形态学改变经8周不同药物治疗干预后，各组大鼠肾组织HE染色、显微镜下观察，光镜下病理结果(见彩图10)：正常组大鼠肾组织结构正常；模型组大鼠大部分肾小球见系膜基质轻度结节样增生，部分肾小球伴见散在系膜细胞增生；参芪组和PD98059组大鼠肾组织病理变化均较模型组轻，仅见局灶肾小球系膜基质增生，部分肾小球见节段性增生；参芪组和PD98059组大鼠相比较，肾小球系膜增生变化无明显差异。各组大鼠肾组织均未见肾小球硬化表现。附图：1A1B1C1D彩图10：HE染色（×400）：1A为正常组；1B为模型组；1C为参芪组；1D为PD98059组。Fig10:HEstaining:1afornormalgroup;1bforthemodelgroup;1cforginsengandastragalusgroup;1dforPD98059group.3.6免疫组化检测各组大鼠肾皮质组织ERK信号转导通路相关蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达检测结果显示（见彩图11、12、13）：正常组大鼠肾组织无ERK、p-ERK22 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究及MKP-1蛋白表达迹象，其余各组大鼠肾小球及肾小管细胞均见散在分布的棕黄色斑点。与模型组相比，参芪组和PD98059组的棕黄色斑点明显减少；参芪组和PD98059组之间的比较则无明显差异。附图：2A2B2C2D彩图11：免疫组化(ERK×400):2A为正常组；2B为模型组；2C为参芪组；2D为PD98059组。Fig11:immunohistochemical(ERK):2afornormalgroup;2bforthemodelgroup;2cforginsengandastragalusgroup;2dforPD98059group.3A3B3C3D彩图12：免疫组化(p-ERK×400):3A为正常组；3B为模型组；3C为参芪组；3D为PD98059组。Fig12:immunohistochemical(p-ERK):3afornormalgroup;3basthemodelgroup;3cforginsengandastragalusgroup;3dforPD98059group.4A4B4C4D彩图13：免疫组化（MKP×400):4A为正常组；4B为模型组；4C为参芪组；4D为PD98059组Figure13:immunohistochemical(MKP):4afornormalgroup;4basthemodelgroup;4cforginsengandastragalusgroup;4dforPD98059group23 讨论4.讨论4.1DN的发病现状及分期DN是DM最严重的并发症之一，发生率较高，在1型DM和2型DM中肾脏受累率约为40%[7]，是DM患者重要的死亡原因。DN诊断按照国际公认的Mogensen分期标准[8]，根据病程及病理生理演变过程将糖尿病肾脏改变分为5期，轻重与肾小球硬化程度呈正相关。I期：肾小球高滤过期。以肾小球滤过率（GFR）增高和肾体积增大为特征，GFR可高达150ml/min；尿白蛋白排出率（UAE）正常（<20μg/min，或<30mg/24h）；血压正常。病理：肾小球肥大，基底膜（GBM）和系膜正常。这种糖尿病肾脏受累的初期改变与高血糖水平一致，是可逆的，经过治疗可以恢复，但不一定能完全恢复正常。此期没有病理组织学的损害。Ⅱ期：正常白蛋白尿期。GFR增高或正常；UAE正常（<20μg/min，或<30mg/24h），应激后可升高，休息后可恢复；血压可正常或轻度升高。病理：肾小球毛细血管基底膜（GBM）增厚和系膜基质增加。Ⅲ期：早期糖尿病肾病期。GFR大致正常；UAE持续20～200μg/min（或30～300mg/24h），初期UAE20～70μg/min时，GFR开始下降至接近正常(130ml/min)；血压轻度升高，降低血压可部分减少尿微量白蛋白的排出。病理：GBM增厚和系膜基质增加更明显，已有肾小球结带型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并已开始出现肾小球荒废。此期多发生在病程>5年的糖尿患者。Ⅳ期：临床糖尿病肾病期或显性糖尿病肾病期（DN）。GFR下降(早期130～70ml/min，后期70～30ml/min)，平均每月下降1ml/min；大量白蛋白尿，UAE>200μg/min，或持续尿蛋白>0.5g/24h，为非选择性蛋白尿，约30%的患者可出现典型的糖尿病肾病“三联征”———大量尿蛋白(>3.0g/24h)、水肿和高血压的肾病综合征特点；血压增高。病理：GBM明显增厚，系膜基质增宽，荒废的肾小球增加（平均占36%），残余肾小球代偿性肥大。Ⅴ期：肾功能衰竭期。GFR进行性下降，多<10ml/min；尿蛋白量增多或可因肾小球荒废而减少，血尿素氮和肌酐增高；伴严重高血压、低蛋白血症、水24 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究肿以及尿毒症症状。病理：肾小球广泛硬化、荒废，肾小管萎缩及肾间质纤维化。4.2现代医学对DN发病机制的研究DN所致慢性肾衰竭的预后明显较其他病因所致者差，治疗上至今仍未有行之有效的方法。早期DN即Mogensen分期的Ⅲ期，此时如能及时有效的治疗，可逆转肾脏损害，延缓病情进展，若错过早期治疗的机会，就会发展为中晚期DN。因此研究DN的发病机制，并在DM的过程中阻止或延缓并发肾病具有重要意义。现代医学研究认为DN的发病机制十分复杂，涉及糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、细胞因子作用、氧化应激反应等多个方面。在研究DN发病机制过程中发现，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族信号通路的激活在一定程度上导致和加速了DN的发生、发展。MAPK是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，它在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。研究发现，MAPK在DN体内实验研究和体外培养的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞中活性明显上调，提示MAPK在DN的发生和发展过程中起着重要的作用[9]。在真核细胞中，已经鉴定出四条MAPK信号转导通路，而其中之一的ERK信号转导通路是目前阐述最早最完全的经典途径，是MAPK家族中第一个被克隆的成员[10]，它可被多种DN的致病因子激活，将信号从细胞膜表面受体转导至核，参与G-蛋白偶联受体介导的一系列免疫反应，促使FN分泌增多，肾小球系膜细胞增生、肥大以及分泌的系膜外基质进行性积聚[11]。FN是肾小球系膜基质的重要成分之一，常被作为基质积聚程度的一个重要指标。激活的ERK也调节了原癌基因c-fos的表达，其表达产物FOS能和JUN通过亮氨酸拉链形成二聚体AP-1样转录因子，提高与DNA的结合能力，从而细胞增殖、分化、发育和肥大[12]。正是这些细胞增生、分化、肥大等而使肾基底膜增厚和细胞外基质积聚成为DN疾病发生发展的关键。大量的体外细胞培养报道认为ERK信号转导通路积极参与了巨噬细胞介导的肾损伤[13]、参与肾小球基底膜的破坏、参与了TGF-β介导的细胞外基质产生[14][15]、参与了FN生成[16]，也影响了活化蛋白1的表达来促进DN的发生[17]。因而探明ERK信号转导通路在DN中的作用机制，从而对DN早期进行积极的防治，可能是防治DN的有效途径之一。PD98059（2-氨基-4-异氧黄铜）是ERK抑制剂，主要用于抗肿瘤，研究证25 讨论明作为抗肿瘤的ERK通路ERK1/2抑制剂PD98059具有阻断高糖引起的MMP-9mRNA增加和MMP-9活性升高，从而减轻肾小球基底膜的破坏，延缓DN的进程[16]。4.3本实验的结果及意义本研究观察到，左肾切除加高糖高脂饲料喂养联合小剂量STZ成功诱导出DM大鼠模型。经8周不同药物干预治疗后，综合分析常规指标及生化指标检测结果（具体如前文所述）结合HE染色光镜下可见正常组大鼠肾组织结构正常，模型组大鼠大部分肾小球见系膜基质轻度结节样增生，部分肾小球伴见散在系膜细胞增生，参芪组和PD98059组大鼠肾组织病理变化均较模型组轻，仅少数肾小球见系膜基质轻度结节样增生，参芪组和PD98059组大鼠相比较，肾小球系膜增生变化无明显差异，各组大鼠肾组织均未见肾小球硬化表现；免疫组化检测各组大鼠肾皮质组织ERK信号转导通路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1的表达检测结果显示正常组大鼠肾组织无ERK、p-ERK及MKP-1蛋白表达，其余各组大鼠肾小球及肾小管细胞均有表达，与模型组相比，参芪组和PD98059组的表达明显减轻，参芪组和PD98059组之间的比较则无明显差异，发现模型大鼠均符合早期DN改变。因此，本实验认为ERK信号转导通路的激活在DN的发生发展中具有十分重要的地位和作用，参芪降糖颗粒对DN肾损害具有明显的多靶点、多途径保护作用，可防治或延缓DN的进展，其可能的作用机制如下：（1）降低肾重/体重比值。与正常组相比，模型组、PD98059组、参芪组均显著增大（P均＜0.01）；与模型组相比，参芪组明显低于模型组（P＝0.01），而PD98059组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与PD98059组相比，参芪组与之无统计学差异（P＞0.05）。这可能是参芪降糖颗粒和PD98059抑制ERK通路的激活，抑制肾小球系膜细胞分泌FN,进而抑制肾小球系膜细胞增殖、分化、发育和肥大及基质增生作用的结果，也可能与各模型组大鼠左肾切除后右肾代偿性增生肥大有关。（2）减少24h尿量。本研究显示在24h尿量方面：与正常组相比，模型组、PD98059组均显著大于正常组（P＜0.01），参芪组与正常组之间相比无明显差异（P＞0.05）；与模型组相比，参芪组明显小于模型组（P＜0.05），PD98059组与26 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究模型组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与PD98059组相比，参芪组显著减少（P＜0.01），这与参芪降糖颗粒明显降低DM大鼠血糖，减轻了高血糖渗透性利尿的作用有关。（3）在血肌酐浓度方面：各组大鼠两两比较均无显著差异。是因为各组大鼠均处于早期DN，肾小球滤功能尚正常，尚未影响体内肌酐的清除。（4）在尿肌酐浓度方面：各组大鼠两两比较均无显著差异。是因为各组大鼠均处于早期DN，肾小球滤功能尚正常，尚未影响体内肌酐的清除。（5）在CCr水平方面：内生肌酐为体内肌酐代谢产生，每天生成量相对稳定，肌酐通过血流经肾小球滤过后基本不被肾小管吸收，随尿液排出体外。在控制条件下，尿中肌酐排泄量相当稳定。单位时间内肾脏将若干毫升血中的内生肌酐全部清除出去，称为内生肌酐清除率，也称为24h肌酐清除率，是用于判断肾小球损害的敏感指标：Ccr能较早反映肾小球滤过功能，Ccr低到正常值的50％，血BUN、Cr仍可正常；也可用于评估肾功能损害程度：肾衰竭代偿期：80～51ml/min；肾衰竭失代偿期：50～20ml/min，肾衰竭期：19～10ml/min，尿毒症期：<10ml/min；还用于指导治疗和肾衰竭用药参考。本实验观察到正常组、参芪组、模型组、PD98059组四组之间两两比较均无显著性差异（P值均＞0.05）。这可能是各模型组大鼠均处于早期DN，肾脏损害比较轻，肾小球滤过率正常，未影响到内生肌酐的清除功能。（6）降低血糖和GHb。高血糖是DN发生发展的关键因素，而其他因素则是重要的加重因素[7]。高血糖以及晚期糖基化终末产物（Advancedglycosylationendproducts，AGEs）可启动代谢途径参与DN的发生；高血压、血脂代谢异常是加重DN的独立危险因素。它们都可通过复杂的信号传导产生大量的细胞因子及生长因子参与调节DN的发生和发展。DN患者因高血糖、胰岛素抵抗（Insulinresistance，IR）等代谢紊乱引起血管内皮损伤和功能障碍，在此基础上Ⅷ因子相关抗原激活Ⅱ因子，最终使纤维蛋白原含量增加。血Ⅷ因子相关抗原和纤维蛋白原含量明显增高时，导致血液流变学异常，表现为高凝、高黏等，从而加重肾缺血、缺氧，加速肾脏损害。控制血糖就是遏制DN发生发展源头。另外血糖降低同时可改善血液粘稠度，调节肾脏血流动力学，降低肾小球高滤过状态。研究表明，DM病人早期即27 讨论有肾血流动力学改变，并直接参与DN的发生发展，而肾小球高滤过是导致DN发生中功能与形态改变的基础。本研究观察显示，在血糖值方面：与正常组相比，模型组和PD98059组均显著升高（P＜0.01），参芪组与正常组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，参芪组和PD98059组均显著降低（P＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组明显低于PD98059组（P＜0.01）。在GHb值方面：与正常组相比，参芪组、模型组与PD98059组均显著增高（P值均＜0.01）；与模型组相比，参芪组与PD98059组均显著降低（P值均＜0.01）；与PD98059组相比，参芪组显著低于PD98059组（P＜0.01）。说明参芪降糖颗粒有确切的降低血糖的功效，这与文献报道一致[18]，能通过降低血糖从源头控制住DN的发生和发展。（7）抑制肾小球系膜细胞分泌FN。本研究发现在血清FN值方面：与正常组相比，模型组明显升高（P＜0.05），参芪组、PD98059组与正常组相比均无显著差异（P值均＞0.05）；与模型组相比，参芪组、PD98059组显著降低（P值均＜0.01）；而与PD98059相比，参芪组与之差异无统计学意义（P＞0.05）。故而推测参芪降糖颗粒和PD98059能显著抑制肾小球系膜细胞分泌FN，抑制肾小球系膜基质增殖，同时使进入血液的FN量明显减少。细胞因子结缔组织生长因子（Connectivetissuegrowthfactor，CTGF）可以上调肾小球系膜细胞中FN、Ⅰ型及Ⅳ型胶原蛋白等ECM的表达，此过程是转化生长因子-β（TGF-β）依赖和非依赖的[19]。有人研究利用离体培养发现高糖环境下人肾小球系膜ERK的活性明显增强，同时其增殖活跃分泌FN明显增加，而当加入ERK1/2激酶的特异性抑制剂PD98059后，人肾小球系膜细胞增殖明显受到抑制，分泌FN明显减少。（8）降低尿蛋白可以减轻尿蛋白对肾小球系膜细胞的直接损害，减少生长因子及肾小管细胞释放的血管活性物质等,因此延缓了DN的发生与发展[20]。蛋白尿不但是肾病的表现，也是损伤肾脏和加重肾损害的因素，同时还是判断肾病预后的指标之一。蛋白尿的发生与肾小球足细胞结构是否完整有非常密切的关系，足细胞是肾小球滤过屏障的最外层，足突间的裂孔隔膜以大小选择性方式来限制血浆蛋白滤过，构成阻止血浆蛋白丧失的最后屏障。当足细胞受到损伤时，足突的正常结构破坏、消失，足细胞缺乏增殖再生能力，不能有效覆盖基底膜，肾小球滤过膜完整性破坏，导致蛋白尿发生[21][22]。研究表明氧化应激可直接作28 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究用于肾组织细胞膜的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，最终导致基底膜的通透性升高，足细胞死亡，ECM沉积，肾小球纤维化[23]。本研究观察到在UAER值方面：参芪组与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，PD98059组与参芪组显著降低（P值均＜0.01）。参芪降糖颗粒可有效减少DN大鼠尿蛋白，其机制可能与该药具有抗氧化应激、拮抗氧自由基脂质过氧化对肾小球足细胞的损伤作用有关，此外本实验已证明参芪降糖颗粒可降低血糖，故其机制可能还与通过降低血糖，调节肾脏血流动力学，降低肾小球高滤过状态有关。（9）抑制ERK通路的激活。本实验结果发现参芪组大鼠血清FN明显低于模型组大鼠，与PD98059组大鼠及正常组大鼠无明显统计学差异，病理改变及ERK通路相关蛋白表达均较模型组大鼠减轻，与PD98059无明显差别，说明参芪降糖颗粒与PD98059有相似的作用，能通过阻断ERK信号转导通路，从而阻止细胞外信号从细胞膜表面受体转导至核，使肾小球系膜基质的重要成分之一FN分泌减少；同时也下调了原癌基因c-fos的表达，降低了与DNA的结合能力，进而抑制肾小球系膜细胞增殖、分化、发育和肥大及基质增生，减缓肾小球的硬化，延缓DN病情的进展。4.4中医对DN的认识DM属中医“消渴”范畴，消渴病名最早见于《内经》，如《素问·奇病论》曰：“此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”；《金匮要略》有专篇对消渴的证治进行阐述，立有白虎加人参汤、肾气丸等有效方剂，至今为临床医家所推崇；后世医家在《内经》和《金匮要略》的基础上，对消渴的病因病机、临床表现、并发症以及治疗都有补充和发展。许多医家依据本病三多症状的偏重不同，将消渴分上、中、下三消为治。近现代认为导致消渴的病因有饮食不节，情志失调，劳欲过度及禀赋不足等方面；其病机主要为燥热阴亏，五脏虚弱；而发病过程以阴虚为本，燥热为标；其病位主要在肺、脾（胃）、肾；病情迁延则气阴两虚，阴阳俱衰；由于脏腑虚损，常导致变证百出；辨证分型为津伤燥热、阴精亏虚、气阴两虚、阴阳两虚及瘀血阻滞[24]；治疗以养阴生津，清热润燥为基本原则。中医无DN病名记载，但是历代医家对其论述颇多，认为DN是DM的变证，属于中医的“尿浊”、“水肿”、“关格”、“肾消”、“虚劳”等范畴。巢元方在其29 讨论《诸病源候论》中曰：“夫消渴者，多演变为聋盲痤痱疮癣，或水液妄行则面上肿也。”戴元礼在《证治要诀》中曰：“三消久则小便不臭，反而作甜气，溺中滚涌，更显浮溺，面有如猪脂，此为精不禁，而真元竭也。”两位中医名家为DM演变为DN的过程做了生动描述。DN是由消渴日久，阴虚燥热，津液亏损，导致脾胃不得濡养和肾精不得资助而造成[25][26]，证属“本虚标实”，“阴虚燥热，脾肾亏虚”是本病的主要病机[27]。DN出现蛋白尿，是身体中精华物质的丢失，与“肾虚不固”有关，证属“脾肾亏虚，水湿泛滥”，治宜“益气养阴，健脾补肾”[28]。现代也认为DM治疗不及时或治疗不当可以诱发变证[29]，DN是其变证之一。在中医病机方面,多数学者认为早期DN以阴虚为本,涉及肝肾,辨证为气阴两虚,脉络瘀阻，后期发展为脾肾两虚，水湿泛滥，而成水肿，益气养阴为其基本治疗原则。针对DN的治疗临床上有分型论治和分期论治：由于DN的病程长，病因病机复杂，DN的分型亦颇为复杂，熊玮[30]调查DN患者中医证候分布特点,显示早期DN期出现率高的证型依次为气阴两虚证(53.18%),肝肾阴虚证(46.12%)，显示气阴两虚型是DN基本证型；司富春[31]等检索了近15年公开发表的中医、中西医结合治疗DN的文献260篇,将文献中DN证型名称进行标准化归类为54个,气阴两虚、脾肾阳虚、血瘀、阴阳两虚、肝肾阴虚、肾气虚和肾阴虚为主要证型，占67.70%，可见本病临床分型的复杂性。分期论治是符合本病发展规律的论治方案，并经长期探索，显示出优势，吕仁和教授[32]将DN分为虚损期、虚劳期、虚衰期3期；任爱华等[33]按照三焦理论分早期、临床期、肾功能失代偿期三期治疗DN；2007年糖尿病中医防治指南,将DN分为发病初期、病变进展期、病变晚期3个阶段进行论治。另外还有专方专药治疗及中成药治疗等。到目前为止，仍未形成统一的、公认的辨证分型或分期的论治标准，亦未发现特效治疗方法及药物。参芪降糖颗粒是纯中药降糖制剂，主要有人参皂甙、五味子、山药、地黄、麦冬、黄芪、覆盆子、茯苓、天花粉、泽泻、枸杞子等11味中药组成，主治消渴病，用于2型糖尿病，具有益气养阴、滋脾补肾之功效，参芪降糖颗粒组方中人参功用补阴助阳，益脾气，乃扶阳益阴之良药；黄芪功用补肺气，升清阳，布精微，乃补气升阳之良药，两者大补元气，气盛则得以化生津液，共为君药；30 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究地黄、天花粉、麦冬功用清热养阴、生津润燥止渴，共为臣药；枸杞子、覆盆子、五味子功用补肾摄精、益肝肾，扶土摄精，共为佐药；山药、茯苓、泽泻功用养胃同肾，三焦并理，上补肺金生津止渴，中培脾土输津布液，下助肾气而缩尿益精。全方组方合理，诸药合用，标本兼治，兼顾先天(肾)和后天(脾)，共凑益气养阴、益肾健脾之功效[34]。现代药理研究证明,人参皂苷有刺激葡萄糖氧化,促进糖原分解或抑制乳酸合成肝糖原的作用[35]。黄芪、山药益气健脾，有降糖作用。黄芪可降低血糖,提高机体免疫力，增加胰岛素的敏感性。地黄、麦冬的水提取剂对正常和四氧嘧啶实验性糖尿病小鼠显示有降糖作用。枸杞子有降糖降脂作用。泽泻、茯苓降血脂。麦冬、枸杞子、天花粉、地黄、覆盆子、五味子等滋阴药物能使实验动物的肝糖原输出减少[36],从而降低空腹及餐后血糖。临床研究表明参芪降糖颗粒可明显改善临床症状,而且能够降低血糖、改善胰岛素、C肽水平,尤其适用于2型DM气阴两虚证型的治疗。现代医学科学研究也表明，DM的发病与Zn、Cr、Mg、Mn、Se等微量元素缺少也有关。①锌与胰岛素之间有密切关系，锌缺乏能使胰岛素分泌减少。DM病人的血锌明显下降。补锌将是DM综合治疗措施之一。②铬对糖代谢有重要作用。DM病人的血铬明显低于正常人，DM病人食用含铬食品后，血糖、尿糖都有不同程度下降。③在糖代谢过程中，镁促进糖通过细胞膜，促进糖的氧化磷酸化和糖酵解，故缺镁可导致糖代谢紊乱。④锰缺乏时，胰岛β细胞数量减少，机体糖耐量降低，糖的利用率降低，导致DM。⑤动物实验表明,硒能明显促进细胞摄取糖的能力,具有与胰岛素相同的调节糖代谢的生理活性。有研究[37]表明参芪降糖颗粒含有Na、Mg、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Mo等人体必需元素。因此，参芪降糖颗粒对DN的良好治疗作用除了上述机制外还应与该药能补充相关的微量元素有关。31 结论5.结论通过本实验研究，我们总结得出以下结论：5.1通过左肾切除术联合高糖高脂喂养加小剂量STZ单次腹腔注射，能有效复制出类似于人类2型DM并发肾病大鼠模型，在造模成功后2个月内属DN模型早期，与文献报道一致。5.2参芪降糖颗粒能减轻早期DN大鼠肾脏肥大，降低肾脏指数；明显减少早期DN大鼠24h尿量，使24h尿量接近于正常；能有效降低早期DN大鼠血糖及GHb水平；能有效减少肾小球系膜细胞分泌FN，明显减少血清FN的含量；能有效减少早期DN大鼠尿蛋白的排泄，减轻尿蛋白对肾小球系膜细胞的直接损害，减少生长因子及肾小管细胞释放的血管活性物质等，延缓了DN发生发展。5.3参芪降糖颗粒能有效抑制ERK信号转导通路的激活，抑制肾脏组织ERK信号转导通路蛋白ERK、p-ERK及MKP-1表达，从而抑制肾小球系膜增生，保护肾功能，防治DN的发生发展。5.4参芪降糖颗粒对DN具有多靶点、多途径防治作用。32 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究6.问题与展望本课题基于前期良好的研究基础，以早期DN为研究对象，以ERK信号转导通路为切入点，采用益气养阴中药参芪降糖颗粒进行干预，并使用ERK信号转导通路阻滞剂进行对照，课题具有较好的先进性，有一定的理论与临床应用价值，技术路线可行，但是也存在一些值得注意之处：6.1在今后进一步的研究中，应动态观察DN大鼠相关指标的变化以及药物干预后相关指标的动态变化，有利于了解DN的发生发展过程，有利于观察药物作用靶点及作用机理。6.2ERK信号转导通路指标选择将进一步选择3个以上进行研究。6.3DN大鼠模型造模方法有待改进。以改变耗时长、对大鼠的伤害大、大鼠死亡率较高、耗费较大等问题。6.4随着对DN的深入研究，中医药诊治DN转向分子机制的深入研究中稍显滞后，今后应在临床研究中结合中医理论和现代科技，联合多家单位共同进行大样本的治疗观察，探索建立符合中医辨证的动物模型，并根据调查结果制定公认的标准，从而为DN的诊治提供更加可靠、全面、系统和科学的依据。6.5在不断完善不足的同时，充分发挥传统医学的优势,针对DN患者生存质量以及改善临床症状或指标等方面进行药物或疗法研究，挖掘民间验方开展临床试验，服务应用于临床，进一步明确合适的药物配伍剂量关系，这些都将成为未来中医药治疗DN深入研究的努力方向。33 参考文献7.参考文献[1]何泽，李瑛．老年糖尿病肾病临床中药治疗最新进展［J］．中国老年学杂志，2012，32(19):4344－4346[2]FraserD,BrunskillN,ItoT,etal.Long-termexposureofproximaltubulerepithelialcellstoglucoseinducetransforminggrowthfactor-beta1synthesisviaanautocrinePDGFloop[J].AmJPathol,2003,163(6):2565-2574.[3]徐杰.中医药治疗糖尿病肾病研究的新进展[J].陕西中医,2010,31(4):506-508.[4]高苹,贾钕汗.2型糖尿病肾病大鼠模型的建立.中国中西医结合肾病杂志,2007,8(6):316-319.[5]黄贤珍,杨亦彬.参芪降糖颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织缺氧诱导因子-1α表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(1):61-63.[6]何卫美,宋育林,方芳,等.MEK/ERK通路在高脂饮食诱导NAFLD大鼠SREBP-1表达中的作用.胃肠病学和肝病学杂志,2010,19(5):427-431.[7]王吉耀.内科学[M].北京：人民卫生出版社,2010.614.[8]MogensenCE．Earlyglomerularhyperfiltrationininsulin-dependentdiabeticsandlatenephropathy［J］．ScandJClinLabInvest，1986，46(3):201．[9]刘晔,赵林双.MAPK信号转导在糖尿病肾病免疫机制中作用的研究进展[J].微循环杂志,2011,21(2):71-73.[10]郑铭,张幼怡,韩启德.肾上腺素受体的丝裂原活化蛋白激酶信号途径[J].生理科学进展,2003,33(2):111-114.[11]HuangD,DingY,LuoWM,etal.InhibitionofMAPKkinasesignalingpathwayssuppressedrenalcellcarcinomagrowthandangiogenesisinvivo[J].CancerRes,2008,68(1):81-88.[12]王隽,王战建,徐焕宇.罗格列酮对2型糖尿病大鼠肾脏ERK/c-fos蛋白表达的影响[J].中国糖尿病杂志,2011,19(8):624-627.[13]ErwigLP,KluthDC,ReesAJ.Macrophagesinrenalinflammation[J].CurrOpinNephrolHypertens,2001,10(3):341-347.[14]WangL,HuGY,ShenH,etal.FluorofenidoneinhibitesTGF-betalinducedCTGFviaMAPKpathwaysinmousemasangilacells[J].Pharmazie,2009,64(10):680-684.34 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究[15]TianL,LiC,QiJP,etal.Diabetes-inducedup-regulationofUIIanditsreceptorplaysanimportantroleinTGF-betal-mediatedrenalfibrosisanddysfunction[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2008,295(5):1234-1242.[16]白亚玲,黄海长,李惊子，等.高糖通过ERK1/2途径调节足细胞产生明胶酶B［J］.中华医学杂志，2005，85(21):1451-1455.[17]高景燕,李新荣,邓红,等.高糖对人肾小球系膜细胞MAPK活性的影响[J].东南大学学报,2003,22(6):366-368.[18]叶卓,吴钧俊.参芪降糖颗粒治疗2型糖尿病疗效分析[J].实用中医药杂志,2009,25(12):788-789.[19]MasonRM．Connectivetissuegrowthfactor(CCN2)，apathogenicfactorindiabeticnephropathy．Whatdoesitdo?Howdoesitdoit?［J］．JCellCommunSignal，2009,3(2):95．[20]EddyAA,GiachelliCM.RenalexpressionofgenesthatpromoteInterstitialinflammationandfibrosisinratswithprotein-overloadproteinuria[J].KidneyInt,1995,47：1546.[21]JeffersonJA，ShanklandSJ，PichlerRH．Proteinuriaindiabetickidneydisease:amechanisticviewpoint．KidneyInt，2008，74:22-36．[22]MundelP，ShanklandSJ．Podocytebiologyandresponsetoinjury．JAmSocNephrol，2002，13:3005-3015．[23]CottoneS，MuleG，GuarneriM，etal．Endothelin－1andF2－isoprostanerelatetoandpredictrenaldysfunctioninhypertensivepatients［J］．NephrolDialTrasplant,2009,24(2):497－503．[24]田德禄.中医内科学[M].北京：人民卫生出版社,2002.322-328.[25]王卫群，石檑．消渴病的辨证分型及择时服药规律探讨［J］．新疆中医药，2012，30(6):4－6[26]王海英．糖尿病肾病中医病因病机与治则治法研究进展［J］．医学信息，2013，2(3):373－374[27]吕志波．老年糖尿病肾病的中医临床分析及应对探讨［J］．中国医药指南，2013，11(8):607－608[28]迪丽努尔·吐尔洪，马丽．金洪元教授中医治疗糖尿病肾病的经验［J］．时珍国医国药，2012，23(9):2380－238135 参考文献[29]王义沛，罗南凤．传统中医对消渴症“糖尿病”的致病分析［J］．中国西部科技，2013，12(1):52－54[30]熊玮．.2型糖尿病肾病证候分布调查及早期主证治疗[J].浙江中医杂志,2006,41(8):437-438．[31]司富春,李建省.中医药治疗糖尿病肾病证型方药分析［J］.中医研究，2010,23(8)：26-28.[32]肖永华.吕仁和治疗糖尿病肾病经验[J].世界中医药，2007，2(3)：151-153.[33]任爱华，阐方旭.糖尿病肾病三焦辨治[J].山东中医杂志,2000,20(6):8-9.[34]毛春谱，李小毅，李伟，等．参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病患者血清TGF－β1、VEGF的影响［J］．第三军医大学学报，2010，32(13):1475－1476[35]关子安,孙茂欣.现代糖尿病学[M].天津:天津科学技术出版社,2000.234-238.[36]岳凤先,陈传楚.中药的现代研究[M].北京:中医古籍出版社,1998.150.[37]李春花李春丽李智辉..参芪降糖颗粒中微量元素与其疗效关系的研究[J].广东微量元素科学,2004,11(11):44-47.36 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究综述1：参芪降糖颗粒防治糖尿病肾病的研究现状摘要：DN是DM最常见和最严重的慢性微血管并发症之一，是导致ESRF的主要原因。中医认为气阴两虚是DN的基本病机，是DN发生发展的最根本条件，益气养阴是DN最基本的治疗法则。大量临床及实验研究证明益气养阴中药参芪降糖颗粒在防治DN时发挥了多靶点、多途径的作用，显示出了较好的疗效，且无明显毒副作用。本文就参芪降糖颗粒防治DN的最新研究进展作一综述。关键词：糖尿病肾病；参芪降糖颗粒；综述1.DN病名探讨DM属中医“消渴”，若治疗不及时或治疗不当可以诱发变证[1]。中医无DN病名记载，但是历代医家对其论述颇多，认为DN是DM的变证，属于中医的“尿浊”、“水肿”、“关格”、“肾消”、“虚劳”等范畴。巢元方在其《诸病源候论》中曰:“夫消渴者，多演变为聋盲痤痱疮癣，或水液妄行则面上肿也。”戴元礼在《证治要诀》中曰:“三消久则小便不臭，反而作甜气，溺中滚涌，更显浮溺，面有如猪脂，此为精不禁，而真元竭也。”两位中医名家为糖尿病演变为DN的过程做了生动描述。DN是由消渴日久，阴虚燥热，津液亏损，导致脾胃不得濡养和肾精不得资助而造成[2-3]，证属“本虚标实”，“阴虚燥热，脾肾亏虚”是本病的主要病机[4]。DN出现蛋白尿，是身体中精华物质的丢失，与“肾虚不固”有关，证属“脾肾亏虚，水湿泛滥”，治宜“益气养阴，健脾补肾”[5]。2.DN病因病机研究DN发病机制十分复杂。夏城东[6~8]等总结国内外学者有关DN现代医学病因病机的研究认为,DN病因及发病机理尚未完全阐明。一般认为,病因主要包括肾小球高滤过、生化代谢紊乱、氧化应激、蛋白激酶C活化、细胞因子异常分泌、血液流变学变化及遗传易感性等多因素相互影响，最终导致DN发生。在中医病机方面，多数学者认为早期DN以阴虚为本，涉及肝肾，辨证为气阴两虚，脉络瘀阻。熊玮[9]调查IDN患者中医证候分布特点，显示早期DN期出现率高的证型依次为气阴两虚证(53.18%)，肝肾阴虚证(46.12%)，显示气阴两虚型是DN基本证型。37 综述3.参芪降糖颗粒临床研究3.1改善血糖、血脂代谢高血糖以及糖基化终末产物（AGEs）可启动代谢途径参与DN的发生;高血压、血脂代谢异常是加重DN的独立危险因子。它们都可通过复杂的信号传导产生大量的细胞因子及生长因子参与调节DN的发生和发展。李滨等[10]在常规治疗基础上给予参芪降糖颗粒联合缬沙坦治疗，并设对照组给予缬沙坦治疗。结果显示参芪降糖颗粒联合缬沙坦治疗DN，具有明显的降糖、降压、调脂及保护肾脏作用，疗效明显优于对照组。董学锋[11]在常规西医治疗的基础上加服参芪降糖颗粒，观察治疗12周，并设立对照组。结果发现常规西医加用参芪降糖颗粒治疗2型DM降糖效果显著，优于单用西医常规治疗。叶卓等[12]给予对照组口服二甲双胍治疗，治疗组口服参芪降糖颗粒治疗。结果显示治疗组总有效率治疗组93.3%，对照组73.3%。发现参芪降糖颗粒能降低血糖、改善胰岛素、C肽水平，尤其适合气阴两虚型2型DM患者。3.2降低尿蛋白蛋白尿不但是肾病的表现，也是损伤肾脏和加重肾损害的因素，同时还是判断肾病预后的指标之一。蛋白尿的发生与肾小球足细胞结构是否完整有非常密切的关系，足细胞是肾小球滤过屏障的最外层，足突间的裂孔隔膜以大小选择性方式来限制血浆蛋白滤过，构成阻止血浆蛋白丧失的最后屏障。当足细胞受到损伤时，足突的正常结构破坏、消失，足细胞缺乏增殖再生能力，不能有效覆盖基底膜，肾小球滤过膜完整性破坏，导致蛋白尿发生[13][14]。近年研究表明：高血糖是DM是微血管病的始发因素,严格控制血糖有助于防治或延缓DN的发生与发展。施炜等[15]通过临床观察发现参芪降糖颗粒对气阴两虚之2型DM有明显降糖作用,对早期DN有非常明显的降低尿白蛋白排泄量的作用。作者认为参芪降糖颗粒降低早期DN尿白蛋白的排泄量可能与其降低血糖的作用有关。刘芳洁等[16]在常规治疗基础上联合应用参芪降糖颗粒治疗早期DN，并设立对照组。结果发现在常规处理基础上加用参芪降糖颗粒有助于早期DN患者肾功能的恢复，且不良反应轻微。38 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究苗林艳等[17]观察发现参芪降糖颗粒联合西药治疗DN，能有效降低尿蛋白、血脂、血糖、糖化血红蛋白，较单用西药治疗比较，有显著差异。王姝文[18]在常规治疗基础上加参芪降糖颗粒治疗早期DN，并设立对照组。结果治疗组治疗尿蛋白排出量显著降低，对照组无明显改变。张俊[19]在常规治疗基础上加以参芪降糖颗粒合血塞通治疗早期DN患者，对照组仅予以常规治疗。结果发现参芪降糖颗粒合血塞通治疗能明显减少患者尿蛋白，疗效显著优于对照组，对肾功能有确切保护作用。3.3调节细胞因子与炎症因子近年研究表明炎症反应是T2DM发生、发展和加重IR的重要因素，细胞因子及炎症介质介导的炎症反应是DN发生发展的重要途径[20]。炎症机制与其他机制一起，或作为其他机制的下游环节，对肾脏产生损伤，加速DN进展，在DN的持续发展中起着关键作用[21]。hs-CRP是肝脏合成的一种急性时相反应蛋白，是非特异性炎症标志物，其受多种细胞因子的调节和诱导。其生物学特性主要表现为识别和激活某些炎症介质，激活补体，活化炎性细胞进入肾脏微循环系统，参与了DN的发生、发展[22]。张红梅等[23]在常规西药治疗的基础上加服参芪降糖颗粒，并设立对照组。结果发现中西药联合使用治疗气阴两虚、脾肾不足型DM患者，疗效明显优于单纯西药治疗，对DN具有良好治疗效果。作者还发现hs-CRP与UAER呈显著正相关，提示炎症与UAER相关，即与DN肾脏损伤程度平行，与文献报道相似[24]。毛春谱等[25]在常规西药加用参芪降糖颗粒。观察3个月发现参芪降糖颗粒对早期DN具有良好治疗效果，作者认为其对肾脏的保护作用可能是通过抑制TGF-B1、VEGF的表达实现的。4、基础研究4.1实验研究狄灵等[26]观察发现参芪降糖颗粒大剂量(2.0g/kg)对STZ诱导的DM大鼠有明显降低血糖的作用，同时升高C肽含量，增加DM大鼠的胰岛素水平；并对实验性DM大鼠胰岛B细胞有明显保护作用。作者认为修复、改善受损的胰岛细胞功能，促进胰岛素分泌可能是其作用机制。39 综述黄贤珍等[27]用参芪降糖颗粒治疗STZ诱导建立的DN大鼠模型，给药8周后检测结果发现肾脏肥大指数降低，24h尿蛋白、血BUN、血Cr降低；肾组织HIF-1a和HO-1蛋白表达明显降低，疗效明显优于对照组。作者认为参芪降糖颗粒可能通过影响肾组织HIF-1a和HO-1的表达，实现对DN大鼠肾脏保护作用。4.2药物成分研究李春花等[28]采用电感耦合等离子体质谱法，对参芪降糖颗粒中元素成分进行了分析。发现参芪降糖颗粒对DM及DN的疗效与其中的微量元素有关。参芪降糖颗粒含有Mg、K、Ca、Cr、Mn、Zn、As、Se、Mo等元素，其中部分元素为人体必需元素。据报道，DM主要与Zn、Cr、Mg、Mn、Se有关[29]。5、问题与展望随着中医临床对DN研究的深入，中西医结合防治DN的优势逐渐被认同，且由于在治疗疾病根本、延缓病情进展上具有明显的优势，展现出中医药防治DN良好的发展前景。但也存在一些问题与不足，如（1）各家经验学说虽多，但多仅限于临床观察，基础理论研究偏少，且样本量较少，遣方用药各异，缺乏统一的辨证分型、治则治法以及疗效评判标准，不便推广，且造成研究经费较高以及人力物力的浪费；其次是缺少联合糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变等微血管病变的综合研究；再者中医药诊治DN转向分子机制的深入研究中稍显滞后。（2）今后应在临床研究中结合中医理论和现代科技，联合多家单位共同进行大样本的治疗观察，探索建立符合中医辨证的动物模型，并根据调查结果制定公认的标准，从而为DN的诊治提供更加可靠、全面、系统和科学的依据。（3）研究药物的选择：目前研究涉及的药物众多，这对于寻找有效药物是必要的，但也造成经费投入分散，建议对有好苗头的药物集中力量，深入研究，对已上市中药的研发，是中药研究的一项重要课题，已上市的中药具有良好的前期研究基础，但对其临床疗效及确切的机制，却常是一项空白，如能对其进行深入的研究，不但有利于其更好的临床应用，也有利于其现代化及国际化。参考文献:[1]王义沛，罗南凤．传统中医对消渴症“糖尿病”的致病分析［J］．中国西部科技，2013，40 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究12(1):52－54.[2]王卫群，石檑．消渴病的辨证分型及择时服药规律探讨［J］．新疆中医药，2012，30(6):4－6.[3]王海英．糖尿病肾病中医病因病机与治则治法研究进展［J］．医学信息，2013，2(3):373－374.[4]吕志波．老年糖尿病肾病的中医临床分析及应对探讨［J］．中国医药指南，2013，11(8):607－608.[5]迪丽努尔·吐尔洪，马丽．金洪元教授中医治疗糖尿病肾病的经验［J］．时珍国医国药，2012，23(9):2380－2381.[6]夏城东,丁学屏,叶伟成．中医药治疗糖尿病肾病的机制研究[J]．中国中西医结合杂志,2002,22(3):224-226．[7]DanielPE.RifkinDiabetesmellitus[M].5thed.Beijing:Science-press,2000.971-1008.[8]JeanDW,DanielWF,HenryMK,etal.Williarmstextbookofendocrinology[M].9thed.Bejing:SciencePress,2001,1014-1022．[9]熊玮．.2型糖尿病肾病证候分布调查及早期主证治疗[J].浙江中医杂志,2006,41(8):437-438．[10]李滨，初晓芳，陈岩等．.参芪降糖颗粒联合缬沙坦治疗2型糖尿病肾病疗效观察[J]．现代中西医结合杂志，2014，23(10):1090-1091．[11]董学锋.参芪降糖颗粒治疗2型糖尿病210例的临床效果分析[J].中国农村卫生事业管理2011,31(4),424-425.[12]叶卓,吴钧俊.参芪降糖颗粒治疗2型糖尿病疗效分析[J].实用中医药杂志,2009,25(12):788-789.[13]JeffersonJA，ShanklandSJ，PichlerRH．Proteinuriaindiabetickidneydisease:amechanisticviewpoint[J]．KidneyInt，2008，74:22-36．[14]MundelP，ShanklandSJ．Podocytebiologyandresponsetoinjury[J]．JAmSocNephrol，2002，13:3005-3015．[15]施炜,苏如松.参芪降糖颗粒对初期糖尿病肾病保护作用研究[J].中医药学刊2001,19:496,500.[16]刘芳洁,张国梁,刘海英.参芪降糖颗粒辅助治疗早期糖尿病肾病临床观察[J].中国中医急症,2013,22(11):1945-1946.41 综述[17]苗林艳,李雪艳,胡志红等.参芪降糖颗粒治疗糖尿病肾病80例临床观察[J].中国社区医师.医学专业,2011,11:173-174.[18]王姝文.参芪降糖颗粒治疗早期糖尿病肾病疗效观察[J].辽宁中医杂志,2008,35(11):1710.[19]张俊.参芪降糖颗粒合血塞通减轻早期糖尿病肾病肾损害作用观察[J].中医药临床杂志,2010,22(4):312-313.[20]WilliamsMD，NadlerJL．Inflammatorymechanismsofdiabeticcom-plications［J］．CurrDiabRep，2007，7(3):242-248．[21]朱辟疆．糖尿病肾病抗炎治疗的研究进展［J］．中国中西医结合肾病杂志，2007，8(11):671-673.[22]回园敕，向红丁，冯凯等．2型糖尿病患者血超敏c反应蛋白和微血管并发症的关系[J]．中国实用内科杂志，2007，27（15）：1190.[23]张红梅，毛春谱，李小毅等.益气养阴、补脾益肾法对糖尿病肾病患者血清hs-CRP、尿UAER等指标的影响[J].江苏中医药,2009,41（12）:24-25.[24]杨彦，熊萍．川芎嗪注射液对23例糖尿病肾病患者血糖、尿蛋白及C反应蛋白的影响[J].江苏中医药，2008，40（1）：34.[25]毛春谱,李小毅,李伟.参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病患者血清TGF-B1、VEGF的影响[J].第三军医大学学报,2010,32(13):1475-1476.[26]狄灵,厉英倩,张薇.参芪降糖颗粒对实验性糖尿病大鼠胰岛B细胞、C肽及血浆胰岛素释放的影响[J].第四军医大学学报,2003,24(19):1774-1776.[27]黄贤珍,杨亦彬.参芪降糖颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织缺氧诱导因子–1a表达的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(1):61-63.[28]李春花,李春丽,李智辉.参芪降糖颗粒中微量元素与其疗效关系的研究[J].广东微量元素科学,2004,11(11):44-47.[29]雷永乐.微量元素与糖尿病[J].广东微量元素科学,1995,2(12):70～71.42 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究综述2：中医药防治糖尿病肾病的作用机制研究进展摘要：近年中医药在防治糖尿病肾病方面取得了不少成绩，临床医家对中医药防治该病的作用机制也做了很多研究，现作一综述。关键词：糖尿病肾病；中医药；综述糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的微血管并发症，是造成终末期肾脏疾病的主要原因。近年来，DM发病率有明显上升的趋势，因此加强对DN的防治研究显得尤为迫切。DN的发病机制涉及糖脂代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、细胞因子作用、氧化应激反应等多个方面。中医药防治DN的机制研究基本都是围绕这些机制展开的，且在近几年取得了一定的进展，现总结如下。1.对糖脂代谢紊乱的影响高血糖以及糖基化终末产物（AGEs）可启动代谢途径参与DN的发生；高血压、血脂代谢异常是加重DN的独立危险因子。它们都可通过复杂的信号传导产生大量的细胞因子及生长因子参与调节DN的发生和发展。1.1抑制蛋白质非酶糖基化及AGEs的生成张雪竹等[1]研究表明，糖复康能显著下调AGEs的表达，抑制DM时蛋白质非酶糖基化。文平凡等[2]在西医治疗的基础上给予黄连四物汤，发现不仅能显著降低血浆AGEs水平，还能下调血糖、血脂。1.2改善糖脂代谢全红[3]观察发现藿朴夏苓汤对DN患者的空腹血糖、胆固醇、甘油三脂等指标均有明显改善作用。涂元宝等[4]研究发现常规西医治疗加降糖活血利水方能使Ⅳ期DN患者FPG、HBA1C、平均动脉压、TC、TG、LDL等显著降低。2.调节肾脏血流动力学研究表明，DM病人早期即有肾血流动力学改变，并直接参与DN的发生发展，这其中肾小球高滤过起到关键作用。而糖代谢紊乱、血管活性物质的释放等诸多因素的综合作用形成了肾血流动力学异常。2.1对血管活性因子的调节研究[5]表明，ET-1是迄今所知体内最强的缩血管物质，是导致DN患者肾小43 综述球硬化的重要因素。CRP可使肾小球系膜细胞增生，促进DN的发生发展。陈汉礼等[6]研究发现用金水宝胶囊联合山楂消脂胶囊治疗早期DN，能使ET-1、CRP降低，血流动力学改善，肾小球内“三高”效应改善。在DN发病过程中，AngⅡ、GMP-140发挥着重要作用。苏衍进等[7]研究发现糖肾一号胶囊通过调节血浆AngⅡ及GMP-140水平改善肾脏血流动力学，防止肾小球硬化。2.2改善血液粘稠度DN患者因高血糖、IR等代谢紊乱引起血管内皮损伤和功能障碍，在此基础上vWF:Ag激活Ⅱ因子，最终使Fbg含量增加。血vWF:Ag和Fbg含量明显增高时，导致血液流变学异常，表现为高凝、高黏等，从而加重肾缺血、缺氧，加速肾脏损害。这一病理过程与中医“久病入络”、“久病必瘀”理论是一致的。有人对213例Ⅲ～Ⅴ期的DN患者分析发现，血瘀证贯穿DN始终。刘尚建等[8]回顾性调查116例DN住院病例，探讨其血瘀证与尿蛋白的相关性，研究表明:血瘀证可能是导致DN患者尿蛋白增多的原因，并提示临床上加大活血化瘀药的力度，可能可以减少患者的蛋白尿。王秀霞等[9]在西医治疗基础上加服益气补肾活血利水方，并用丹参、红花煎水泡足治疗DN患者，结果患者血液流变学及肾脏微循环均明显改善。魏连波等[10]观察发现大黄蟅虫丸能显著降低Ⅳ期DN患者血vWF:Ag、Fbg含量，改善高凝状态。D-二聚体在DN的发生、发展中充当了重要角色[11]。张爱军等[12]在西医治疗基础上加服逐瘀通脉胶囊治疗早期DN，结果患者血浆D-二聚体水平明显降低。3.调节细胞因子与炎症因子近年研究表明炎症反应是T2DM发生、发展和加重IR的重要因素，细胞因子及炎症介质介导的炎症反应是DN发生发展的重要途径[13]。炎症机制与其他机制一起，或作为其他机制的下游环节，对肾脏产生损伤，加速DN进展，在DN的持续发展中起着关键作用[14]。3.1对参与细胞外基质代谢的细胞因子的作用研究表明，DN发展过程中多种因素可促使TGF-β1表达异常升高，从而使MMP-9和TIMP-l的作用失衡，导致ECM堆积。吕芹等[15]发现益气养阴化浊通络方可降低血清TGF-β1，调节MMP-9、TIMP-1水平，影响ECM代谢调控44 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究系统。3.2对参与细胞增殖的细胞因子的作用CTGF可以上调肾小球系膜细胞中FN、Ⅰ型及Ⅳ型胶原蛋白等ECM的表达，此过程是TGF-β依赖和非依赖的[16]。蔡文等[17]研究表明益气养阴化浊通络方可降低DN患者CTGF及IV型胶原水平，延缓DN的发展。3.3对IL-6、IL-8等炎症因子的作用丘余良等[18]研究发现DN患者随着肾功能的下降，血清CRP、IL-6、Hcy等炎症因子也进行性上升，使用益肾降浊冲剂加常规西医治疗能降低DN患者的血清CRP、Hcy水平，减轻炎症状态。白雪梅等[19]观察发现红花黄色素加常规西医治疗可减低早期DN患者血清IL-8、hs－CRP的表达，抑制炎症反应，对肾脏起到保护作用。高志田等[20]观察发现，黄葵胶囊结合西医常规治疗，可明显降低DN患者CRP及TNF水平，可能具有调节DN患者微炎症状态的作用。4.对氧化应激的调控氧化应激可直接作用于肾组织细胞膜的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，最终导致基底膜的通透性升高，足细胞死亡，ECM沉积，肾小球纤维化[21]。MDA是氧自由基脂质过氧化的最终产物，它能使细胞膜变性、衰老和死亡。楼南方等[22]研究发现DN患者应用丹红注射液后MDA、AngⅡ水平下降，病情改善。朱丽等[23]研究发现，早期DN患者体内即出现明显氧化应激状态，予三七总甙干预后，患者体内SOD、GSH活性明显提高，MDA含量明显降低，氧化应激状态明显改善。江芝婷等[24]研究发现胰岛素联合糖肾方治疗DN可以改善体内低甲基化及氧化应激水平。5.对其他因素的影响研究认为IR和瘦素抵抗可能促进了DN的发生与发展，逆转IR可以延缓DN的进展。张秋林等[25]研究表明金锁固精丸加味方能显著降低DN患者LPT水平和胰岛素抵抗指数，增加胰岛素敏感指数，延缓DN的进展。祁明明等[26]整理表明：雷公藤制剂具有免疫调制、抗炎、调节细胞因子、保护足细胞的作用。许成群等[27]分析研究表明：大黄能抑制系膜细胞及肾小管上皮细胞增生，改善肾血流量，延缓DN的发展。辛爽清[28]发现常规西医加肾炎康复片能降低尿白蛋白，同时降低尿白蛋白排泄率，对DN患者肾脏有一定保护作用。45 综述6.结语中医药防治DN已取得了较大的进展，研究也较深入，研究涉及的方药众多，涉及DN发病机制的多方面，虽然目前尚无一个较为公认有效的中药新药问世，但相信随着研究的不断深入，中医药在防治DN方面将取得更大的成就。然而从目前中医药防治DN的机制研究分析，还存在一些值得进一步加强的问题，笔者认为主要有以下几个方面：1）加强早期防治的研究：DN不但继发于DM，还可通过IR，在出现DM之前即出现DN。因此在DN早期，对IR进行干预，极有可能延缓甚至阻止DN的发生发展。中药黄芪多糖、小檗碱等有改善IR的作用，同时具有肾脏保护作用，加强对这类中药的研究，对于在更早期对DN进行防治，具有重要的意义。2）蛋白尿防治机制的研究：DN早期一个重要的临床表现就是蛋白尿。研究表明，足细胞及其相关分子的异常，是导致DN蛋白尿的重要机制。但在研究降蛋白尿的机制中，较少涉及对足细胞这一关键影响因素的研究。因此建议在中医药防治DN的机制研究中，尤其是防治DN蛋白尿机制的研究中，加强这方面探讨。3）研究药物的选择：目前研究涉及的药物众多，这对于寻找有效药物是必要的，但也造成经费投入分散。建议对有好苗头的药物集中力量，深入研究。对已上市中药的研发，是中药研究的一项重要课题。已上市的中药具有良好的前期研究基础，但对其临床疗效及确切的机制，却常是一项空白，如能对其进行深入的研究，不但有利于其更好的临床应用，也有利于其现代化及国际化。参考文献：[1]张雪竹,赵凯利,戴琦,等.中药糖复康胶囊对早期糖尿病肾病炎性因子的影响[J].中国中药杂志,2003,28（5）:452-455.[2]文平凡,黄桂琼.黄连四物汤治疗早期糖尿病肾病的临床疗效观察及对血清AGEs水平的影响[J].中华中医药学刊,2011,29(4):921-923.[3]全红.藿朴夏苓汤加减治疗糖尿病肾病的效果分析[J].临床和实验医学杂志,2012,11(8):589,591.[4]涂元宝,李传平,束永兵,等.降糖活血利水方治疗Ⅳ期糖尿病肾病疗效观察[J].中医药学报,2012,40(2):82-85.[5]黄雯,冯维华.糖尿病肾病与血浆内皮素1和C反映蛋白的相关性研究[J].中国糖尿病杂志,2009,17(11):842-843.46 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究[6]陈汉礼,周茹,陆标明.金水宝胶囊合山楂消脂胶囊对早期糖尿病肾病血浆内皮素Ⅰ及C反应蛋白的影响[J].湖南中医药大学学报,2010,30(6):35-37.[7]苏衍进,马居里,王郁金.糖肾一号胶囊对早期糖尿病肾病患者血浆AngⅡ及GMP-140影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(2):227-228.[8]刘尚建,刘变玲,孙卫卫,等.116例糖尿病肾病患者血瘀证与尿蛋白的相关性研究［J］．中国中西医结合肾病杂志,2012,13(2):142-143.[9]王秀霞,王玉中,康美清.中药内服外用对早期糖尿病肾病血流变及IL-6的影响[J].新中医,2011,43(1):44-46.[10]魏连波,栗德林,叶任高,等.大黄蟅虫丸对非胰岛素依赖型Ⅳ期糖尿病肾病患者Ⅷ因子相关抗原及纤维蛋白原的影响[J].中医杂志,2003,44（1）:30-32.[11]CobanE,SariR,OzdoganM,eta1.Levelsofplasmafibrinogenandd-dimerinpatientswithimpairedfastingglucose[J].ExpClinEndocrinolDiabetes,2005,113(1):35-37.[12]张爱军,李莉,罗芳.逐瘀通脉胶囊对糖尿病早期肾病患者胱抑素C和D二聚体的影响[J].中国医药指南,2011,9(34):182-183.[13]WilliamsMD，NadlerJL．Inflammatorymechanismsofdiabeticcom-plications［J］.CurrDiabRep，2007,7(3):242-248．[14]朱辟疆.糖尿病肾病抗炎治疗的研究进展［J］．中国中西医结合肾病杂志，2007，8(11):671-673.[15]吕芹,卞华,韩迪,等.益气养阴化浊通络方对早期糖尿病肾病患者TGF-β1，MMP-9，TIMP-1表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(15):287-290.[16]MasonRM．Connectivetissuegrowthfactor(CCN2)，apathogenicfactorindiabeticnephropathy．Whatdoesitdo?Howdoesitdoit?［J］．JCellCommunSignal，2009,3(2):95．[17]蔡文,吕芹,韩迪.益气养阴化浊通络方对早期糖尿病肾病患者CTGF，IV型胶原及CysC表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(14):266-268.[18]丘余良,阮诗玮,吴竞,等.益肾降浊冲剂对糖尿病肾病Ⅳ期患者炎症相关因子的影响[J].光明中医,2010,25(7):1167-1169.[19]白雪梅,李向东,宋洁,等.红花黄色素对早期糖尿病肾病患者hs－CRP、IL－8的影响[J].中国中西医结合肾病杂志,2012,13(8):698-700.[20]高志田,王刚.黄葵胶囊对糖尿病肾病患者微炎症状态的观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2011,12(12):1104-1105.47 综述[21]CottoneS，MuleG，GuarneriM，etal．Endothelin－1andF2－isoprostanerelatetoandpredictrenaldysfunctioninhypertensivepatients［J］．NephrolDialTrasplant,2009,24(2):497－503．[22]楼南方,连续,李桂芹,等.丹红注射液对糖尿病肾病患者血浆丙二醛、血管紧张素II水平的影响[J].牡丹江医学院学报,2011,32(4):13-15.[23]朱丽,侬光彪.三七总甙片对早期糖尿病肾病患者氧化应激状态的影响[J].疑难病杂志,2010,9（4）：284-285.[24]江芝婷,梁琼麟,王义明,等.糖肾方对糖尿病肾病患者同型半胱氨酸代谢的影响[J].中国中西医结合杂志,2011,31(8):1057-1061.[25]张秋林,周俭玲,郭阶明,等.金锁固精丸加味方对糖尿病肾病瘦素的影响[J].中华中医药学刊,2011,29（8）:1767-1770.[26]祁明明，孙伟.糖尿病肾病诊疗中雷公藤制剂的应用探究[J].实用中医内科杂志，2010,24（1）:17-20.[27]许成群,徐明松,王元.大黄治疗糖尿病肾病的研究概况[J].中医药导报，2011，17（4）：123-125.[28]辛爽清.肾炎康复片治疗糖尿病肾病22例疗效观察[J].中国中西医结合肾病杂志,2010,11(5):450-451.48 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究附录：研究路线图SD大鼠DN造模：左肾切除1周、高糖高脂喂养4周，单次腹腔注射STZ，72h后血糖>16.7mmol/L,为DM造模成功正常组糖尿参普病芪通肾降PD98059喂病糖阳性对照养模颗组型粒组组观察大鼠一般情况正常组、模型组、参芪组、PD98059组均治疗干预8周后集中处死，留取血液、尿液、肾脏标本。尿液检测：24小时尿微肾脏检测：血液检测：量白蛋白、HE染色病理组织形态学观察；血糖、GHb、尿肌酐、24h免疫组化法检测各组肾脏组织血肌酐、血清尿量测定。ERK信号通转导路相关蛋白FN。ERK、p-ERK及MKP-1的表达。数据比较、图像分析、机制探讨49 攻读学位期间发表论文情况攻读学位期间发表论文情况已发表论文《糖尿病肾病中医药治疗现状》（综述）——《中医药临床杂志》（2014年3月第26卷第3期）《中医药防治糖尿病肾病的作用机制研究进展》（综述）——《中国中西医结合肾病杂志》（2014年6月第15卷第6期）50 参芪降糖颗粒对早期糖尿病肾病大鼠肾组织ERK通路的影响及作用机制研究致谢光阴似箭，日月如梭，转眼之间三年的研究生学习即将结束，值此论文完成之际，向关心我的老师、同学及家人致以最衷心的感谢！首先，我要感谢我的母校能再次给我学习深造的机会。1993年母校让我初次步入医学殿堂，激起我学习医学的兴趣，让我懂得了一些医学基础知识，使我毕业后顺利的成为一名救死扶伤的医生，并且一直孜孜不倦的工作了16年，2012年母校再次给我学习提高的机会，这将为我今后更好地工作，更好的为人民服务打下更为坚实的基础！同时，感谢我的恩师董昌武教授。三年来，董老师在繁忙的工作中一直对我的学习、生活给予无微不至的关怀与帮助，让我能安心地学习，使我能学有所获、学有所成。老师科学严谨的治学态度，精益求精的工作作风，深深感染和激励着我并将使我受益终身。在此谨向董老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！感谢周雪梅老师对我的研究课题精心设计与悉心指导，感谢您的谆谆教诲，您的渊博的学识及严谨的科研作风将是我一生学习的榜样！感谢安徽省中医院内分泌科主任、主任医师、博士生导师方朝晖教授及全体医护人员在临床见习中给予我的悉心教导，感谢方老师对我课题的精心指导以及在我学习和生活上给予的支持与帮助，您的渊博的学识及高尚的医德将是我一生学习的榜样！感谢陈雪功教授对我孜孜不倦的指导、对我的论文逐字逐句的修改和润色，您的渊博的学识和高尚的品德将使我终身受益！感谢我的同学汪莉、凌含鹏、罗云、陈维天等，室友袁松、王海涛、白云飞，师弟胡正远、叶双林，师妹刘婷婷、洪乐等给予的帮助！感谢我的家人给予我的默默支持！最后衷心感谢各位答辩专家对我论文的指导与帮助！再次谢谢所有关心和帮助过我的老师、亲人、同学与朋友们，谢谢！51 作者简介作者简介一、个人资料姓名：杨才顺籍贯：安徽芜湖繁昌性别：男政治面貌：中共党员民族：汉族在读专业：中医内科学出生年月：1973.12二、主要学习、工作经历1990年9月～1993年7月繁昌县第一中学学习1993年9月～1996年7月安徽中医学院学习1996年9月～2012年8月繁昌县中医院工作2012年9月～至今安徽中医药大学学习三、参与科研工作参与安徽省高等学校省级自然科学研究项目《参芪降糖颗粒对糖尿病肾病大鼠肾组织ERK信号转导通路的影响及其作用机制研究》（项目编号：KJ2013Z178）的研究工作。52