动物源大肠杆菌对乙酰甲喹和氟苯尼考的敏感性折点及分子耐药机制研究

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1、分类号：单位代码：密级学号：博士学位论文动物源大肠杆菌对乙酰甲喹和氟苯尼考的敏感性折点及分子耐药机制研究研究生何涛指导教师吴聪明教授合作指导教师汪洋副教授申请学位门类级别农学博士专业名称基础兽医学研究方向兽医药理学与毒理学所在学院动物医学院年月Ph.D.DissertationStudyonthesusceptiblebreakpointandmolecularresistancemechanismformequindoxandflorfenicolagainstanimal-derivedE.coliPh

2、.D.Candidate:TaoHeSupervisor:ProfessorCongmingWuCo-Supervisor:AssociateprofessorYangWangMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryPharmacologyandToxicologyCollege:CollegeofVeterinaryMedicineChinaAgriculturalUniversityJune,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我

3、个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研宂成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名时间：年曰关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农

4、业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）本研宄受国家十二五科技支撑计划项目“食品安全风险评估关键技术研究”课题“动物源性食品重要致病菌耐药性检测与风险评估技术研究”的资助。摘要抗菌药物敏感性判定标准（折点）是开展病原菌耐药性检测，确定其耐药率、耐药水平的重要技术标准，目前世界上比较权威的折点制定组织有美国临床实验室标准化研宄所（和欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（，而我国没有设立

5、制定折点的机构，因此参考的主要是国外的标准。国外标准对一些中国自主研制的新兽药比如乙酰甲喹没有建立敏感性折点；同时国内兽医临床的某些常用剂型，比如氟苯尼考粉剂针对大肠杆菌感染，国外的标准也没有涉及。乙酰甲喹和氟苯尼考是国内兽医临床使用较为普遍的抗菌药物，在控制动物的大肠杆菌感染性疾病发面发挥了巨大作用，而敏感性折点的缺乏严重影响了这两种药物的耐药性监测工作的开展。针对以上问题，本研究将参照国外建立折点的标准流程，系统调查国内动物源大肠杆菌对乙酰甲喹和氟苯尼考的敏感性表型及分子耐药机制，在此基础上设定两种药物

6、针对大肠杆菌的野生型折点，通过动物模型初步探讨与临床效力最为相关的参数，以期为折点的制定提供数据基础。本研宄收集了年代、年代、年代、年年国内不同地区不同动物来源的株大肠杆菌，通过微量肉汤稀释法测试了乙酰甲喹和氟苯尼考对这些菌株的最小抑菌浓度通过体外药效学试验研究了这两种药物对致病性大肠杆菌的最小杀菌浓度（、防突变浓度（、抗菌后效应（和体外杀菌曲线。结果表明乙酰甲唾对大肠杆菌呈现浓度依赖性的杀菌作用（氟苯尼考对大肠杆菌呈现浓度依赖性的抑菌作用（；两种药物对大肠杆菌都有一定的体外尽管它们的突变选择窗（较宽。年代

7、到年之间，国内动物源大肠杆菌对乙酰甲喹和氟苯尼考的敏感性呈下降趋势，低敏感菌株的比例逐年上升。鸡源大肠杆菌相对猪源大肠杆菌对乙酰甲喹敏感，而两种动物来源的大肠杆菌对氟苯尼考的敏感性情况比较接近。通过分别绘制两种药物对株大肠杆菌分布的直方图，运用统计学方法确定了乙酰甲喹对大肠杆菌的野生型折点为，氟苯尼考对大肠杆菌的野生型折点为。通过检测这些菌株中的喹乙醇耐药基因和相关氟苯尼考耐药基因、、和，发现和基因分别是介导大肠杆菌对乙酰甲喹和氟苯尼考低敏感表型的主要基因，分别占大肠杆菌的和大肠杆菌的，并且基因的检出率随着

8、年代的推移呈上升趋势。首次在一株猪源大肠杆菌中检测到了基因，检出率为基因定位于质粒上，可介导大肠杆菌对氟苯尼考的低敏感表型。耐药基因的检测结果与我们制定的满足耐药表型和基因型的一致。通过基因测序，发现同一动物来源不同大肠杆菌菌株或不同动物来源的大肠杆菌中和基因的同源性都很高，分别达到了和以上，说明大肠杆菌中这两种基因很少发生变异。通过研究科基因和基因在大肠杆菌中的基因环境发现，这些基因的两侧都有方向相同的形成了一