动物源性大肠埃希菌对氟苯尼考耐药的分子机制研究

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1、温州医科大学硕士学位论文分类号：R446单位代码：10343学号：151002368硕士学位论文论文题目:动物源性大肠埃希菌对氟苯尼考耐药的分子机制研究研究生姓名：林潮庆学科专业：临床检验诊断学类型：学术型指导教师：胡云良教授包其郁教授二O一八年五月温州医科大学硕士学位论文论文题目:动物源性大肠埃希菌对氟苯尼考耐药的分子机制研究答辩委员会主席：严杰教授答辩委员会成员：张丽芳教授江明华教授论文答辩日期：2018年5月23日温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要………………………………………………………………1英文摘要………………………………………………………………3缩略

2、词表………………………………………………………………6前言……………………………………………………………………7材料和方法……………………………………………………………9结果……………………………………………………………………33分析与讨论……………………………………………………………45全文小结………………………………………………………………48参考文献………………………………………………………………49附录……………………………………………………………………53致谢……………………………………………………………………54综述及参考文献……………………………………

3、…………………55论文独创性声明………………………………………………………67温州医科大学硕士学位论文动物源性大肠埃希菌对氟苯尼考耐药的分子机制研究中文摘要目的研究动物粪源大肠埃希菌对氟苯尼考的耐药性与耐药水平，了解氟苯尼考抗性基因在大肠埃希菌中的分布情况，并探究抗性基因相关可移动DNA元件的结构及其水平传播机制。同时，本研究试图通过构建细菌氟苯尼考抗性基因表达文库来筛选出新的氟苯尼考抗性基因，深入探究大肠埃希菌对氟苯尼考耐药性形成的分子机制。方法1.从2015-2016年间在我国浙江、河南、山东、山西和四川等地的多个养殖场采集猪、鸡、牛和鸭的新鲜粪便标本，将样本稀

4、释后涂布于LB固体培养基上培养，挑取形态各异的单菌落进行分离纯化；2.对分离纯化好的细菌进行生化鉴定，提取细菌基因组进行16SrRNA基因测序鉴定，确定其细菌种属；3.以分离得到的大肠埃希菌为研究对象，以琼脂稀释法检测粪源大肠埃希菌对酰胺醇类抗生素（氟苯尼考和氯霉素）的最低耐药程度（MIC值）。4.氟苯尼考相关耐药基因的筛查：设计特异性引物通过PCR的方法来检测234株大肠埃希菌中氟苯尼考耐药基因（floR、fexA、fexB、cfr、optrA和pexA）的分布情况，PCR产物测序验证相关基因序列。5.从中挑取猪源大肠埃希菌P12构建氟苯尼考抗性基因表达文库，并对

5、筛选出的抗性片段进行测序和ORF预测。将其中高度怀疑携带抗性基因的片段（包括启动子区域）克隆入pMD19-T载体上，转化至宿主细胞E.coliDH5α中，测定转化子的氟苯尼考MIC值。与对照菌比较，根据其耐药水平的变化来确定氟苯尼考抗性基因。同时提取基因组DNA进行全基因组测序，分析耐药基因及其相关可移动遗传元件的结构。6.大肠埃希菌P12的floR基因水平转移研究：通过滤膜法接合转移试验和转化试验检测大肠埃希菌P12中floR基因所在质粒的水平转移能力，并对接合子和转化子进行验证，分析耐药性基因的水平转移以及质粒与细菌耐药性的关系。1温州医科大学硕士学位论文结果1

6、.本研究共分离得到378株细菌。经生化鉴定和16SrRNA基因测序鉴定，共分离出大肠埃希菌234株，占细菌总数的61.9%，其中猪来源138株、鸡来源72株、牛来源21株、鸭来源3株。2.琼脂稀释法结果显示234株大肠埃希菌中对氯霉素耐药（MICs≥32μg/ml）的菌株有172株，对氟苯尼考耐药的菌株有169株。3.PCR及测序确认210株大肠埃希菌携带floR基因，阳性率89.7%（210/234），5株携带cfr基因，阳性率为2.1%（5/234）。其中，单株携带单个floR基因有205株；共同携带floR和cfr基因有5株；有24株大肠埃希菌未检测出上述氟苯

7、尼考抗性基因。4.通过对大肠埃希菌P12基因组DNA进行随机克隆，得到一个具有氟苯尼考抗性的克隆片段，经测序、注释发现该片段编码8个ORFs，进一步的对这几个ORFs进行克隆表达发现，其中代号为02的ORF（ORF02）确实具有氟苯尼考的耐药活性。5.滤膜法接合转移试验成功获得接合子EC600-P12，琼脂稀释法结果表明接合质粒能介导大肠埃希菌P12对酰胺醇类抗生素（氟苯尼考和氯霉素）产生耐药性。PCR验证其携带floR基因。结论以上结果表明，导致大肠埃希菌对氟苯尼考耐药的分子机制主要是细菌携带floR基因；本研究中大肠埃希菌P12的floR基因定位于质粒上，可