人妊娠特异性β1糖蛋白胶体金检测试纸条的研制

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1、人妊娠特异性β1糖蛋白胶体金检测试纸条的研制DevelopmentofColloidalGoldImmunochromatographicStripofHumanPregnancySpecificβ1Glycoprotein作者姓名：姬朝光专业名称：免疫学指导教师：刘永茂教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月29日中文摘要妊娠特异性β1糖蛋白（PregnancySpecificβ1Glycoprotein,PSG1）是妊娠期间由胎盘滋养层细胞合成的一种蛋白质，合成后外分泌到母体外周血液循环中。在母体血清中PSG1低于正常值的情况下，常常造成一些不良后果，如胎儿发育不良及流产等[1]。同

2、样病理状态下，PSG1也被发现存在于许多肿瘤组织中。作为一种妊娠的特异性糖蛋白，PSG1具有监测胎盘功能、检测胎儿生长受限、检测肿瘤细胞、参与免疫调节、以及维持妊娠期间母体的免疫耐受环境等功能[2]。一般认为,在早孕的诊断、胎盘功能的监测、以及胎儿预后的判定等一些应用上，PSG1蛋白含量的高低可以作为结果判断的一个依据。因此对PSG1的研究也越来越受到重视。先前工作中，实验室已经构建了能稳定表达PSG1单抗的杂交瘤细胞株、重组蛋白的原核表达系统。在此基础上，从中选择两种抗原表面结合位点之间影响小的细胞株。采用双抗体夹心法的原理，以建立一种灵敏特异、快速简便的PSG1检测方法。1.PSG1重组蛋

3、白的表达和纯化复苏具有原核表达质粒的菌株DE3，并扩大培养，制备包涵体蛋白。复性、纯化后，用于后续的检测。纯化后蛋白的浓度为0.6mg/ml。2.PSG1单抗细胞株的筛选。复苏3株单抗细胞株，并对其稳定性进行检测。用叠加法ELISA实验对实验室制备的3株单抗细胞株进行筛选，挑选出抗原识别表位影响小的两株单抗9G6和2D10。3.单克隆抗体的制备以及纯化。取健康小鼠，注射杂交瘤细胞在腹腔中。取腹水来制备单抗，离心后取上清，除去杂质以及表面脂质。然后用G蛋白进一步纯化抗体。SDS-PAGE电泳及WB检测纯化效果。测定其蛋白浓度2D10和9G6分别为1.69mg/ml，1.37mg/ml。ELISA

4、检测抗体的效价大于1:2.48×106。4.制备胶体金，确定标记条件及组装条件。制备胶体金。通过检测其吸收光波长，判断其直径在30nm左右。采用双抗体夹心法，9G6作为标记抗体，2D10作为捕获抗体，包被于硝酸纤维素膜上。兔抗小鼠IgG抗体固定在C线上。并确定了蛋白的标记条件以及组装条件。I5.试纸条的性能评价。组装后，通过对重组蛋白的检测，判断其灵敏度较好。只是在检测天然蛋白时，其灵敏度的降低。检测与胎盘分泌的其他蛋白，可以看出试纸条有较好的特异性。检测不同温度下保存的试纸条，其稳定性良好。本研究获得了活性较好，纯度较高的重组PSG1蛋白以及单克隆抗体，制备了具有良好灵敏度，稳定性以及特异性

5、的PSG1胶体金检测试纸条。下一步需要做的是将检测试纸条定量化，进一步优化条件，使之与天然PSG1蛋白有更加明显的反应，以满足临床检测的需要。关键词：妊娠特异性β1糖蛋白；单克隆抗体；胶体金；免疫层析；检测IIAbstractPregnancy-specificβ1glycoproteinisaproteinwhichissynthesizedbytheplacentaltrophoblastcellsduringpregnancy.Itwassecretedintothematernalcirculationaftersynthesis.Whenconcentrationislowertha

6、nnormal,itoftencausesomeadverseeffects,suchaspoorfetaldevelopmentandabortion.Underpathologicalconditions，PSG1canalsobedetectedinmanytumortissues.Asapregnancy-specificglycoprotein,PSG1havemanyfunctions,suchas:monitoringplacentalfunction,detectionoffetalgrowthrestriction,detectionoftumorcells,involved

7、inimmuneregulationandmaintainingthemother'simmunetoleranceduringpregnancyenvironment.PresentlyconsideredthatthelevelsofPSG1inmaternalserumcanbeusedasareliablereferenceinsuchfiledasdiagnosisofearlypreg