产肠毒素大肠杆菌溶血素hlya的原核表达、多抗制备及相关功能探析

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2、－Ｊ－—＇＇林—．＇／－＊■？？－ｔ遣指导教师姓名：朱国强教授５００９，扬州大学，江巧扬州，２２心申请学位级别：硕去学科专业名称生物学：微■＇■■—、？、、、．：二．．＊论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期；２０１５年６月．＾．‘’’学位授予单位１；扬＾大学；２０１学位授予日期１５年６月，：’、答辩委员会主席；郭爱珍本丫；二？＇誦６＇二年月ｒ舍ｒ．＇户羞乂’＾—处．、？？＾：今結渡分心Ｖ訂．方乂一心扬

3、州大学硕±毕业论文产肠毒素大肠杆菌溶血素ＨｌＡ的原核表达、多抗制备ｙ及相关功能探析ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＨｅｍｏｌｓｉｎＡｌＡｏｆＥＴＥＣｙ巧ｙ）研究生：杨样专业；微生物学导师；朱国强教授扬州大学兽医学院２０１５年６月Ｉ杨样：产厮毒素大肠巧茜溶血素ＨｌｙＡ的原核表这、多抗制备及相关功能探析

4、产肠毒素大肠杆菌溶血素ＨｌｙＡ的原核表达、多抗制备及相关功能探析中文摘要’ｅ一产肠毒素大肠杆菌（Ｅｎｔｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ反础ｍｃＷａＣＯ化ＥＴＥＣ）是种重要的食源性致病菌，可引起人或幼畜（初生蕉羊、楼牛及断奶仔猪）的腹泻，是断奶仔猪腹泻的主要病原＋菌。Ｋ８８ａｃＥＴＥＣ血清型为，其高发病率和髙死亡率的特点给养殖业造成严重的经济损失国内初生及断奶仔猪腹泻的优势血清型，其主要毒力因子包括黏附素菌毛、肠毒素、内毒、、溶血素等Ｈｅａ－ａｂｉｅｎｅｒｏ素水肿病毒素。ＥＴＥＣ的黏附素菌

5、毛、不耐热肠毒素（ｔｌｌｅｔｔｏｘｉｎＬＴ、，）－ｓｔａｂ耐热性肠毒素（ＨｅａｔｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＳＴ）等毒力因子受到广泛关注，但，作为尿路致病性大肠杆菌（ＵｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＣ０化ＵＰＥＣ）、肠出血性大肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｅｇ知ＥＨＥＣ）重要毒力因子的溶血素在ＥＴＥＣ致病机理中的功能却鲜有报道，＋故本研究选择Ｋ８８ａｃＥＴＥＣ作为试验对象，初步探巧溶血素在ＥＴＥＣ致病中的作用。通过ＰＣＲ方法扩增负责表达大肠杆菌Ｃ８３９０２溶血素亚单位ＨｌｙＣ、Ｈ

6、ｌｙＡ的基因卿。－Ａ４原核表达载体ＥＴ２８ａ＋ＥＴ－２８ａ＋－ＷＣ儿经沁，将其克隆至ｐ（），构建重组表达载体ｐ（）ｙ酶切’验证、测序，确定质粒的成功构建。将重组质粒转化至￡．ｃｏ／ｚＢＬ２１ＤＥ３感受态细胞后，（）经－ＩＰＴＧ诱导和ＮｉＮＴＡ亲和层析获得高纯度的離合蛋白ＨｌｙＡ。纯化后的重组蛋白用两种方法免疫新西兰白兔，获得特异性较高的兔源抗ＨｌｙＡ多克隆抗体血清。本研究构建、表Ａ抗体一达并获得高纯度的融合蛋白ＨｌｙＡ，经免疫后成功获得兔源Ｈｌｙ，为进步探巧大肠杆菌溶血素ＨｌｙＡ的生

7、物学功能及致病机理奠定基础。利用ＥＴＥＣ标准株Ｃ８３９０２、已构建的溶血素Ａ如４基因缺失株Ｃ８３９０２ＡＡ沁４和回补株Ｃ８３９０２ＡＡ４／；ＰＣＲ从转录水平研究溶血ＥＴＥＣ沁ｐ如４，通过巧光定量素与其他重要毒力因子的关系－巧细，初步探索了溶血素在细菌胞外的存在形式，并对仔猪空肠上皮细胞ＩＰＥＣ胞系进行了粘附和粘附抑制试验一、细胞形态学观察、细胞毒性试验等系列功能性探索。艮ｅａ－ｌｔｉｍｅＰＣＲ试验结果表明溶血素的缺失使得Ｊ巧＾（编码丝氨酸蛋白酶主要结构亚基）的转录水平上调了

8、８３％（＜０．０１），（编码Ｉ型茜毛主要结构亚基）和ｅ／／公（编码热不ｐ稳定麻毒素主要结构亚基）分别下调约４０％和２１％（ｐＯ．Ｏｌ），／ｆｌｅＧ（编码Ｋ８８菌毛主要结构亚基）显著下调了约２４％（口＜化０５），而对７？把（编码鞭毛丝蛋白主要结构亚基）的转录无显著影响。上述结果表明溶血素与丝氨酸蛋白酶可能存在相互调控机制且溶血素的，表达可能与细菌对宿主细胞的黏附有关。对外膜囊泡ｏｕｔｅｒｍ