负载布鲁菌wboa-s_2株对骨髓源性肥大细胞的活化作用的体外研究

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1、密级：学校代码：10075分类号：学号：20121787医学硕士学位论文负载布鲁菌WboA-S2株对骨髓源性肥大细胞的活化作用的体外研究学位申请人：王晓曼指导教师：曹志然教授学位类别：医学硕士学科专业：药理学授予单位：河北大学答辩日期：二〇一五年六月U.D.C.:CODE:10075ClassifiedIndex:NO:20121787ADissertationfortheDegreeofM.MedicineStudyontheactivationofbonemarrow-derivedmastcellspulsedwithWboA-B.suisinvitroCand

2、idate:Xiao-manWangSupervisor:Prof.Zhi-ranCaoAcademicDegreeAppliedfor:MasterofmedicineSpecialty:PharmacologyUniversity:HebeiUniversityDateofOralExamination:June,2015河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教宵机构的学位或证书

3、所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。作者签名：I曰期：年¥月^•日学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于1、保密口，在年月闩解密后适用本授权声明。2、不保密0。(请在以上相应方格内打“V”)保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为的学位论文，是我个人在导师嘈&&)指导并与导师合作下取得的研究成

4、果，研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的》本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。声明人：1H日期：滅年Z月4日oft年月今曰作者签名：I日期:导师签名：日期：挪上年/月今日摘要摘要目的：探讨BMMC对布鲁菌的识别机制及应答效应以及WboA基因在诱导机体免疫应答中所发挥的作用，为研发以W

5、boA-S2株为靶抗原的新型布鲁菌疫苗和布鲁菌病的防治提供实验依据和研究新思路。方法：1.采用IL-3和SCF体外诱导的方法制备BMMC；根据BMMC培养状态及甲苯胺蓝染色对BMMC进行鉴定；2.分别用布鲁菌WboA-S2株和S2株按感染复数（MOI）100:1负载BMMC，并以正常BMMC为对照，负载15min，30min，45min，60min后分别进行甲苯胺蓝染色和瑞氏-吉姆萨染色，观察负载不同菌种后的不同时间点BMMC的形态学变化，以观察布鲁菌对BMMC的活化效应及WboA基因产物在活化肥大细胞中的作用；3.以FITC标记的布鲁菌WboA-S2株、S2株负载B

6、MMC后激光共聚焦显微镜观察BMMC对布鲁菌WboA-S2株和S2株的摄取状态；4.分别用布鲁菌WboA-S2株和S2株按感染复数（MOI）100:1负载BMMC，并以正常BMMC为对照，负载3h，6h，12h，24h后用ELISA法检测上清中TNF-α，IFN-γ，组胺，IL-1，IL-6，IL-12的含量，以观察负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后BMMC释放生物活性介质的情况；5.RT-PCR法检测正常BMMC的TLR2、4、8与9mRNA的表达；6.分别用布鲁菌WboA-S2株和S2株按感染复数（MOI）100:1负载BMMC，并以正常BMMC为对照，负载12

7、h，24h后收集细胞，采用RT-PCR法观察BMMC载菌后不同时间点TLR2，TLR4，TLR8和TLR9mRNA表达的变化；7.采用流式细胞术检测BMMC负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后12hTLR4和TLR8蛋白的表达。结果：1.负载布鲁菌WboA-S2株和S2株后BMMC的形态学变化（1）甲苯胺蓝染色后光学显微镜下观察：正常BMMC内有很多颗粒；负Ⅰ摘要载布鲁菌WboA-S2株和S2株后15min，两组BMMC即发生明显的脱颗粒；随着负载时间的延长，BMMC内的颗粒逐渐减少，至负载后60min，BMMC胞质内几乎无颗粒存在，且WboA-S2