茶树橙花叔醇合成酶基因的催化功能、时空表达及其调控机理

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1、分类号；Ｓ５７１．１单位代码：１０３６４密级：：１２７２０２６９学号：名後泉也义ｆ学位论文茶树稽花叔醇合成酶基因的催化功能、时空表达及其调控机理Ｃａｔａｌｙ村ＣＦｕｎｃｔｉｏｎ，Ｓｐａ村ＷｅｍｐｏｒａｌＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＲｅｇｕｌａ社ｏｎＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｉｎＣＶｉ／ｉｉｅ／／ｉＶｉ別＇研究生：王富民指导教师：魏书教授合作指导教师：申请学位口类级别：农学硕ｄｂｉ专业名称；墓堂研究方向；茶树生物巧术与种质资源所在学院；茶与食品科巧学院

2、答辩委员会主席：解春２０１５年６月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。■一：研究生签名：时间必ＩＳ年占月化日关于论文使用授权的说明目本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｐ：学校有权，，Ａ保留送交论文的复印件和磁盎允许论文被查阅和借闽可ｙ采

3、用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。意安农业可在同徽大学Ｗ用不同方式不同媒体上、。发表传播学位论文的全部或部分内容密应遵此协议保密的学位论文在解后守）（＾＾＾＾レ）名：：立。仪年研究生签时间＾月日１５一？￡（（第乂！日导师签名时间：广年月＾摘要香气是评价茶叶品质的重要指标之一，茶叶各类挥发性香气物质中萜类物质对成品茶的香气品质有很大影响。最近的研究表明，植物挥发性萜类物质合成酶基因的表达受茉莉酸及其下游的MYC2转录因子的调节。本研究旨在探明茶树中参与主要倍半萜香气物质生物合成的萜类合成酶基因的功能及这些基因的时空表达特点与调控技术，以增进茶叶香气品质

4、和茶树抗逆性。倍半萜中的橙花叔醇具有宜人的香味，它以糖苷态储藏在茶树叶片中是茶叶香气形成的前体物质，其含量的高低决定了茶叶香气的香型和品质。倍半萜是植物逆境诱导的挥发性物质的重要组成成分，它们有多种植物生理学和生态学功能，例如防御功能、抗逆性、植物间的信号传递。因此，研究茶树中的倍半萜变得尤为重要。利用从本实验室前期获得茶树转录组数据中找到的法尼烯焦磷酸合成酶基因、橙花叔醇合成酶基因和转录因子MYC2基因的序列片段，以茶‘农抗早’[Camelliasinensis(L.)O.Kuntzecv.Nongkangzao]鲜叶为试材，通过RACE技术，成功克隆了茶树法尼烯焦磷酸合成酶基因CsFP

5、S、橙花叔醇合成酶基因CsNES和转录因子CsMYC2的全长。CsNES基因全长1659bp，编码含552个氨基酸、分子量为63.5KDa、等电点为5.46；CsFPS基因全长1029bp，编码342个氨基酸、分子量为39.5KDa、等电点为5.67。对CsNES进行在线BLASTX比对，发现该酶具有萜类合成酶的金属离子结合位点“DDxxD”和萜类合成酶的活性位点“EDxxD”。构建该基因原核表达载体，在大肠杆菌中表达获得重组蛋白。利用GC-MS对重组蛋白的产物进行鉴定，发现该蛋白以法尼烯焦磷酸（FPP）为底物时催化生成橙花叔醇和法尼烯，以香叶基焦磷酸（GPP）为底物时催化生成少量的芳樟醇

6、。CsNES的C端与eGFP融合后，在洋葱表皮细胞进行瞬时表达，发现该基因产物定位在细胞质中。此外，对CsNES的表达特点进行分析，发现逆境信号物质茉莉酸甲酯能显著增强橙花叔醇合成酶基因的表达，通过染色体步移技术获得CsNES的启动子742bp，利用在线启动子分析软件PLACE分析启动子序列，分别在-214和-688处发现了两个转录因子MYC2的结合位点E-BOX，说明CsNES受转录因子MYC2调节，参与茉莉酸信号途径。表明该基因可能参与茶树抗逆反应。利用植物双元表达载体pBI121，将CsNES、CsFPS、CsMYC2基因在烟草中进行过表达，已经获得成功获得阳性转基因植物。为了研究茶

7、树倍半萜类物质的生物合成和调控机理，本研究利用转录组数据中的基因片段，克隆了茶树橙花叔醇合成酶及其相关调控关键基因，并对茶树橙花叔醇合成酶进行了原核表达和亚细胞定位，进一步确定了CsNES的生物学功能。对该基因I的启动子进行克隆并分析作用元件，为揭示茶树中橙花叔醇生物合成的调控机理提供了重要基础。对提高农作物抗逆性和提高茶叶香气品质提供理论基础。关键词：茶树，倍半萜，橙花叔醇合成酶，茶叶香气IIAbstractAroma