胍丁胺通过抑制nmda受体活性及其信号通路对糖尿病大鼠视网膜müller细胞保护作用的研究

《胍丁胺通过抑制nmda受体活性及其信号通路对糖尿病大鼠视网膜müller细胞保护作用的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、提要本实验首先体外分离并原代培养SD乳鼠视网膜Müller细胞，建立高糖培养及胍丁胺药物干预的糖尿病视网膜细胞模型，应用CCK-8及LDH法检测细胞存活能力及细胞活性变化，并通过Hoechst染色及AnnexinV/PI流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果显示，高糖环境导致Müller细胞的大量凋亡，一定浓度范围的胍丁胺干预能够抑制高糖诱导的Müller细胞损伤，发挥重要的抗凋亡作用，而NMDA能够封闭胍丁胺的保护效应，提示胍丁胺可能是通过抑制NMDAR发挥对Müller细胞的保护作用的；ELISA及Real-timePCR检测炎症因子TNF-α的分泌及表达情况，发现胍丁

2、胺不仅能够降低TNF-α的释放，还能够抑制其mRNA水平的表达，提示胍丁胺可能通过抑制NMDAR而在基因水平减轻高糖诱导的炎症反应。同时，本实验成功地建立了糖尿病及胍丁胺药物干预的大鼠模型，应用透射电镜及TUNEL染色方法分析糖尿病大鼠视网膜神经细胞的显微结构变化以及凋亡情况，通过体内实验证明胍丁胺干预能够减轻DR大鼠视网膜组织病变程度。应用激光共聚焦扫描成像，相对荧光强度表示细胞内钙离子浓度差异。结果显示高糖环境下Müller细胞内Fluo-3荧光强度显著升高；当进行胍丁胺共孵育后，Fluo-3荧光强度明显降低；当有NMDA加入时，与胍丁胺干预组比较，细胞Fluo-

3、3荧光强度有所升高。此外，通过Westernblot对细胞凋亡途径相关蛋白进行检测，结果显示，高糖环境下Müller细胞中Bcl-2表达降低而Bax蛋白表达增加，胍丁胺干预能够显著增加Bcl-2蛋白水平同时降低Bax蛋白水平，从而抑制细胞凋亡，胍丁胺可能通过对Bcl-2家族蛋白的调节发挥其抗凋亡机制；利用Westernblot检测MAPK信号通路激活情况，发现高糖可能通过激活MAPK通路，促进Müller细胞损伤，而胍丁胺干预可能通过抑制NMDAR的作用，降低MAPK的磷酸化水平，从而发挥其细胞保护作用。本研究的创新之处：1)本实验验证了胍丁胺对糖尿病大鼠视网膜病变的

4、保护作用。2)本实验设计并证明了胍丁胺能够通过作用NMDA受体抑制高糖环境下视网膜Müller细胞的凋亡及炎症反应，可能与其对Bcl-2家族蛋白的调节作用以及抑制MAPK过度磷酸化相关。I中文摘要胍丁胺（Agmatine）通过抑制NMDA受体活性及其信号通路对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞保护作用的研究糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病（DM）最严重和常见的微血管并发症，是成人主要的致盲眼病之一，随着近年来人们生活水平的改善以及饮食结构的变化，我国糖尿病患者不断增多，DR的发病率明显增加。DR早期局限于视网膜内，为非增殖型，随着病程的延长，发展为以新生血管增殖为特征的

5、增殖型病变，患者逐渐出现微动脉瘤、视网膜新生血管、牵拉性视网膜脱离等严重并发症状，造成严重的视觉功能障碍，对患者的正常生活产生极大干扰。既往的研究认为DR主要是一种微血管病变，但近年的研究发现DR同时损害视网膜微血管和视网膜神经元，且视网膜神经退变的发生早于视网膜血管病变，神经损伤在DR发病过程中扮演重要角色。Müller细胞为视网膜神经元提供结构支撑与代谢所需能量，作为视网膜重要的胶质细胞，在视网膜神经节细胞（RGC）的生长、损伤、修复和再生中都起到重要的作用。因此，寻找能够抑制糖尿病Müller细胞的凋亡的药物并研究其作用机理对于DR的预防和治疗具有重要意义。胍丁

6、胺是形成于哺乳动物大脑的一种内源性多胺，可与包括NMDA受体在内的多种受体蛋白、配体门控阳离子通道等相互作用，具有镇痛、抗肿瘤及神经保护作用。研究表明胍丁胺可以在体外抑制氧化应激、低氧或者TNF-α引起的RGC细胞凋亡，但是关于胍丁胺在DR过程中是否存在保护作用及相关作用机制还未见报道。研究发现在STZ诱导的糖尿病大鼠模型大脑皮层中谷氨酸含量和NMDA受体表达量显著升高，NMDA受体表达量及其过度激活可能在糖尿病中起重要作用，而胍丁胺通过阻断NMDA受体活性可以抑制谷氨酸诱导的小脑粒细胞死亡，我们推测胍丁胺可能通过作用NMDA受体进而在糖尿病视网膜损伤过程中发挥保护作

7、用。本论文成功地建立了糖尿病SD大鼠模型及体外高糖诱导细胞模型，观察糖尿病大鼠Müller细胞变化，并同时进行胍丁胺干预，利用体内、体外模型研究胍丁胺干预对DR及Müller细胞的III保护作用及可能的信号机制，为DR的临床治疗寻找新的药物。1.胍丁胺对高糖诱导的Müller细胞生长及凋亡的影响Müller细胞是视网膜组织中的主要神经胶质细胞之一，能够支持神经元并为其提供营养，同时参与神经元的信号传导、保护神经元及内环境的平衡，并维持BRB稳定，为探讨胍丁胺对糖尿病Müller细胞的保护作用，本论文中的体外模型选择高糖培养的大鼠Müller细胞进行干