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1、肝星状细胞和枯否细胞在肝纤维化过程中的相互作用InteractionbetweenHepaticStellateCellandKupfferCellinLiverFibrosis作者姓名：张玉姣专业名称：内科学研究方向：炎症和肝纤维化的关系及机制指导教师：迟宝荣教授学位类别：医学博士培养单位：白求恩第一医院论文答辩日期：2015年6月7日授予学位日期：年月日论文评阅人答辩委员会组成姓名职称工作单位姓名职称工作单位贾继东教授首都医科大学附属北主席金宁一教授中国人民解放军军事医学科京友谊医院学院军事兽医研究所赵作伟教授大连医科大学二附院委员迟宝荣教授吉林大学第一医院段志军教授大连医科大学一附
2、院李玉新教授东北师范大学刘冰熔教授哈尔滨医科大学二附院王丽颖教授吉林大学基础医学院王邦茂教授天津医科大学总医院孟祥伟教授吉林大学第一医院王炳元教授中国医科大学一附院许钟镐教授吉林大学第一医院中文摘要肝星状细胞和枯否细胞在肝纤维化过程中的相互作用背景：病毒、酒精、寄生虫等多种病因都可以导致肝脏纤维化。去除或控制病因可以从一定程度上控制疾病的进展，但部分肝纤维化持续存在。了解肝纤维化的机制是控制肝纤维化进展及逆转肝纤维化的关键。肝纤维化是肝脏损伤修复失衡的结果。在这个过程中，主要涉及两个重要的细胞：肝星状细胞和枯否细胞。肝星状细胞是产生细胞外基质的主要细胞，它的激活和凋亡是肝纤维化的进展和逆
3、转的核心环节。枯否细胞是肝脏固有免疫的重要组成部分，在肝脏的损伤和修复过程中发挥重要作用。同时，二者都位于肝脏的窦周隙。二者从功能上、空间上对肝纤维化的作用使二者成为研究的焦点。目的：1.研究健康和纤维化的人体肝脏内的炎症情况与纤维化情况，以及肝星状细胞的活化情况和枯否细胞的聚集情况；2.研究诱导过程中的巨噬细胞和诱导成功后的巨噬细胞对肝星状细胞细胞系LX-2细胞激活的影响，以及LX-2细胞对两种不同的巨噬细胞的激活及功能的影响。材料与方法：1.肝脏组织和肝脏灌洗液来自于行肝移植手术的供体和受体，其中，硬化肝脏来自行肝移植手术的受体，正常肝脏来自于行肝移植手术的供体。由于从人肝组织中获得
4、星状细胞和枯否细胞的数量有限，我们用人肝星状细胞的细胞系（LX-2细胞）来代替肝星状细胞；用外周血分离出来的单核细胞诱导出的巨噬细胞来代替枯否细胞。实验中用到的外周血购自长春市中心血站。2.采用实时定量聚合酶链反应来观察肝脏的炎症状况（IL-1β,IL-6,IL-10,IIL-12,TNF-α）和纤维化（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）状况；用免疫组织化学方法来研究肝星状细胞（α-SMA）和枯否细胞（CD68）在肝脏内的差异。3.实验中采用单核-巨噬集落刺激因子和巨噬细胞集落刺激因子来分别诱导M1和M2型巨噬细胞。用流式细胞术检测巨噬细胞的表型，用实时定量聚合酶链反应和酶联免疫吸
5、附实验检测细胞因子的表达和分泌。4.肝脏内的枯否细胞部分是从外周血中补充而来，诱导过程中的巨噬细胞与LX-2细胞的相互作用则模拟这个过程。肝脏内的枯否细胞部分是驻扎在肝脏血窦的固有细胞，它的表型随着肝脏内环境的改变而改变，诱导成功后的巨噬细胞与LX-2细胞的相互作用则模拟这个过程。我们分别用诱导过程中的巨噬细胞和诱导成功后的巨噬细胞与LX-2细胞按照1:5的比例进行共培养。用流式细胞术检测巨噬细胞的表型，用实时定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验检测细胞因子的表达和分泌。结果：1.在纤维化肝脏中，促炎性基因（IL-1β,IL-6,IL-12,TNF-α）表达增高，抗炎性基因（IL-10）表
6、达降低，纤维化相关基因表达（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）也增高。多元回归相关性分析表明，促炎性基因的表达与纤维化相关基因的表达呈正相关，抗炎性基因的表达与纤维化相关基因的表达呈负相关，但与调节细胞外基质降解的酶MMP-2没有相关性。此外，在纤维化肝脏中，激活的星状细胞的数量和聚集的枯否细胞的数量较正常肝脏要多。2.M1型巨噬细胞呈油煎蛋样，可以高表达和分泌促炎性细胞因子IL-6,IL-12和TNF-α,抗炎性细胞因子IL-10较低；而M2型巨噬细胞呈长梭状，高表达和分泌抗炎性细胞因子IL-10，促炎性细胞因子IL-6,IL-12,TNF-α则相反。3.诱导过程中的巨噬细胞，无
7、论是向M1型巨噬细胞诱导，还是向M2型巨噬细胞诱导，都可以促进LX-2细胞表达纤维化相关基因（α-SMA,Col1A1,TIMP-1）和调节纤维化的基因（MMP-2,MMP-9），且二者没有明显差异。LX-2细胞可以影响巨噬细胞的极化过程，无论是向M1型巨噬细胞极化，还是向M2型巨噬细胞极化，都表现出相似的表型和功能。4.诱导成功后的巨噬细胞，无论是向M1型诱导，还是M2型诱导，都可II以促进LX-2细胞表达纤维化相关基因（α-SM
