棉蚜对螺虫乙酯抗性机制研究

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1、棉蚜对螺虫乙酯抗性机制研究StudiesofspirotetramateresistancemechanisminAphisgossypiiGlover作者姓名：杨晨专业名称：农业昆虫与害虫防治指导教师：尚庆利副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月1日中文摘要棉蚜对螺虫乙酯抗性机制研究本研究主要以棉蚜（Aphisgossypii）为对象，通过抗性选育获得螺虫乙酯抗性棉蚜品系（SR）及敏感品系（SS），并利用增效剂实验、交互抗性谱测定、差异转录组、蛋白质组测序等方法探究了棉蚜对螺虫乙酯抗性的机制

2、，为棉蚜的综合治理研究提供了理论依据。在敏感品系基础上，筛选50代得到了螺虫乙酯抗性品系。与敏感品系相比，抗性品系成蚜对螺虫乙酯的抗性达到441.26倍，抗性品系三龄若蚜对螺虫乙酯的抗性达到11.97倍。同时，抗性品系对α-氯氰菊酯（237.80倍）和联苯菊酯（37.29倍）产生了较高的交互抗性，而对乙酰甲胺磷（4.65倍）、杀扑磷（4.82倍）、灭多威（4.32倍）、氟氯氰菊酯（3.68倍）、氰戊菊酯（2.96倍）、氟啶虫胺腈（3.33倍）和吡虫啉（2.93倍）产生了低水平的交互抗性。然而，抗性棉蚜对

3、氧化乐果、毒死蜱、马拉硫磷、克百威、溴虫腈和噻虫嗪杀虫剂没有产生交互抗性。增效剂增效醚（PBO）可以显著增强螺虫乙酯对抗性棉蚜的毒力，在成蚜中其增效比达到75.74倍，在若蚜中达到44.13倍。通过Solexa测序技术分析鉴定敏感与螺虫乙酯抗性棉蚜中差异表达基因（DEGs）。分别从SR和SS的cDNA转录组中获得了22,430,522和21,317,732条reads，并组装成35,222条Unigenes。将所得到的Unigenes与NR、SwissProt、GO、COG、KEGG数据库比对，分别获得

4、14,913、9,220、7,922、4,314和4,686条序列的注释信息。与SS品系相比，SR品系有1287个基因表达差异显著，其中包含130个基因表达上调和1157个基因表达下调（P≤0.001）。在这些基因中，有440个基因被成功注解，包括114个上调和326个下调的基因。与SS品系相比，SR品系棉蚜中的热激蛋白70（Hsp70）、UDP-葡萄糖醛酸（UDP-glucuronosyltransferase）表达量显著上调，而ATP合成酶（ATPsynthase）、细胞色素C氧化酶（cytochr

5、omecoxidase）、表皮蛋白（Cuticleprotein）和唾液蛋白（Salivaryglueprotein）等基因表达量显著下调。在所有的SR品系差异表达基因中，CYP6A2是唯一的细胞色素P450上调基因。这些差异表达的基因通过实时荧光定量PCR（real-timeqPCR）验证，验证结果与转录组数据一致。这些数据说明，棉蚜热激蛋白70、UDP-葡萄糖醛酸和CYP6A2等基I因表达量上调可能与螺虫乙酯的抗性相关。运用RNAi验证CYP6A2在螺虫乙酯抗性中的作用，结果表明喂食三龄期抗性若蚜d

6、sRNA-CYP6A248h后的死亡率显著增加，用25、50、100mg/L螺虫乙酯处理的实验组，分别对比相应螺虫乙酯浓度处理的对照组（喂食dsRNA-ECFP）死亡率分别从33.32,45.57和61.38%增加至54.41,67.56和70.05%，这说明CYP6A2与棉蚜对螺虫乙酯的抗性相关。沉默CYP6A2亦能显著提高α-氯氰菊酯对抗性棉蚜的致死率。运用TCA/丙酮法分别提取SR和SS品系棉蚜蛋白，在二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2‐DE）中检测到了大约493个蛋白点。分析SR和SS品系棉蚜的蛋白质图

7、谱后发现，表达量差异超过2倍以上的蛋白点有35个。在这些蛋白点中，有20个蛋白点在抗性品系中表达量显著高于敏感品系，有15个蛋白点在敏感品系中表达量显著高于抗性品系。结合MALDI-TOF/TOFMS质谱分析，对26个差异表达的蛋白点成功进行了鉴定，并把这些蛋白点分为了几个不同的功能组，包括碳水化合物与能量代谢、抗氧化系统、蛋白质折叠、氨基酸代谢、次生代谢和细胞骨架等相关功能蛋白。在这些蛋白质中，我们推测乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、热激蛋白70、泛素结合酶、脂肪酸合成酶和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶等蛋白与棉

8、蚜对螺虫乙酯的抗性相关。研究棉蚜对螺虫乙酯的抗性机制对于分析棉蚜在螺虫乙酯压力下产生抗性的原因，探索棉蚜相应的协同进化机制具有重要意义。而螺虫乙酯抗性棉蚜品系对其他杀虫剂的交互抗性研究能够提供相应的交互抗性数据，为田间不同杀虫剂的合理使用提供理论指导。以上研究结果为棉蚜对螺虫乙酯的抗性机制提供了重要的理论依据，为成功实施棉蚜的抗性治理策略提供了有价值的信息。关键词：棉蚜，螺虫乙酯，交互抗性，转录组，蛋白质组学IIAbstractStudie