棉蚜对吡虫啉抗性机理的研究

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1、山东农业大学博士学位论文棉蚜对吡虫啉抗性机理的研究姓名：石绪根申请学位级别：博士专业：农药学指导教师：王开运20120615山东农业大学博士学位论文中文摘要棉蚜,4phisgossypii(Glover)是一种世界性棉花害虫，由于其世代历期短，繁殖力强，加之田间不合理的用药习惯，导致我国田间棉蚜抗药性迅速发展且抗性背景相当复杂，这为该虫的化学防治造成了严重的困难。吡虫啉作为第一个商品化的新烟碱类杀虫剂，自上世纪90年代初开始推广使用，早已成为田间防治棉蚜的骨干药剂。为了延缓棉蚜对吡虫啉的抗性发展，延长其田间使

2、用寿命，本研究通过室内抗性筛选、生物适合度以及交互抗性研究，系统分析了棉蚜对吡虫啉产生高水平抗性的风险；同时以室内筛选的抗性品系和敏感品系棉蚜为研究材料，利用现代分子生物技术，研究分析了棉蚜对吡虫啉产生抗性的生化和分子机制，旨在为该类药剂的科学使用提供指导。研究结果如下：1、抗吡虫啉棉蚜品系的室内筛选及抗性风险评估以杀死棉蚜群体600／0-70％的剂量对敏感品系棉蚜持续筛选60代后，该品系棉蚜对吡虫啉的抗性达72．8倍，已经产生了高水平的吡虫啉抗性。该棉蚜品系从Fo代筛选至F54代，抗性发展趋势较为平稳，抗性

3、增加至47．0倍，达中等抗性水平；但由Fs4代筛选至F57代，抗性迅速由47．0倍增长至69．5倍，出现抗性突增期：由F57至F60抗性仍有小幅升高，但其发展又趋于缓慢，证明棉蚜对吡虫啉抗性发展趋势呈偏“S"型曲线。该抗性品系对烯啶虫胺(16．O倍)、啶虫脒(12．9倍)、噻虫嗪(11．6倍)、噻虫胺(9．84倍)、呋虫胺(9．50倍)、丁硫克百威(8．38倍)、高效氯氟氰菊酯(6．17倍)、氧乐果(6．13倍)和毒死蜱(5．10倍)均产生了明显的的交互抗性，但对哒螨灵和吡蚜酮的交互抗性水平较低(分别为2．2

4、8倍和4．52倍)。吡虫啉抗性和敏感品系生物学特性研究发现，I心60的蜜露分泌量、体重、若蚜存活率、内禀增长率和周限增长率均有所下降，特别是净生殖率，仅为敏感品系的47．7％，且世代周期延长了1．4天左右，相对适合度下降为O．71。尽管吡虫啉使用中前期棉蚜对其抗性发展比较缓慢，但连续大量使用仍会导致抗性突增，因此尚存在产生高水平抗性的风险。交互抗性问题能够显著影响吡虫啉和大部分常规药剂特别是新烟碱类药剂的防效，在抗性治理中，仅有少数杀虫剂能够作为替代药剂使用。吡虫啉在棉蚜种群上会产生抗性代价，令其生长、发育和

5、繁殖方面均受到一定程度的影响，从而使抗性品系群体增长受到抑制。2、棉蚜对吡虫啉抗性的生化机理研究以室内选育的吡虫啉抗性品系(抗性达72．8倍)和敏感品系棉蚜为材料，分别测定棉蚜对吡虫啉抗性机理的研究了四种解毒酶抑制剂对吡虫啉的增效作用，并且比较了两个品系棉蚜的解毒酶活性。其中SVl、DEM在棉蚜抗吡虫啉品系和敏感品系中均没有表现出明显的增效作用；而TPP和PBo则对吡虫啉起到了明显的增效作用，且在抗性品系中的增效作用显著高于在敏感品系中的增效作用；其中PBO的增效作用最为明显，在抗性品系中的增效比达到了2．9

6、7。酶活性测定结果表明，抗吡虫啉棉蚜品系的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶比活力均高于敏感品系，尤其以羧酸酯酶比活力的提高最明显，而谷胱甘肽．S。转移酶的变化却并不显著。这些结果表明：多功能氧化酶和羧酸酯酶在棉蚜对吡虫啉产生抗性的过程中起到了重要的作用，而乙酰胆碱酯酶也起到了一定的辅助作用。3、棉蚜对吡虫啉抗性的分子机理研究以吡虫啉抗性品系和敏感品系棉蚜为材料，分别克隆了一个羧酸酯酶基因，两个P450单加氧酶六家族基因，五个乙酰胆碱受体d亚基和一个D亚基的eDNA序列，所有基因序列经同源序列比对后证实分别为棉蚜各功能基

7、因。抗性和敏感品系棉蚜的羧酸酯酶及P450单加氧酶基因序列比对后并未发现抗性相关突变，但进一步的荧光定量分析发现，CYP6CY3一J基因在抗性品系棉蚜体内过量表达了5．66倍，羧酸酯酶基因过量表达了1．24倍，仅CYP6CY3—2基因的表达量未出现明显变化(1．03倍)。本研究得到的Aga2与Aga4亚基基因序列与NCBI上已登录的棉蚜乙酰胆碱受体砣和科亚基eDNA序列相比更加完整，包含了翻译氨基酸序列所需的完整开放阅读框。比对各亚基氨基酸序列后发现，在抗性品系棉蚜A91]l亚基上存在单一的位点突变R81T。

8、羧酸酯酶与P450单加氧酶基因的过量表达进一步证实了这两个解毒酶系在棉蚜对吡虫啉的抗性产生中起到了重要的作用。而本研究在抗吡虫啉棉蚜中首次发现的R81T氨基酸取代已被证实能够显著降低乙酰胆碱受体与吡虫啉的亲和力，因此，R81T突变直接导致了棉蚜对吡虫啉高水平抗性的产生。‘综上所述，本研究通过室内选育明确了棉蚜对吡虫啉的高水平抗性风险，并通过抗性机理分析确定了靶标位点突变是棉蚜对吡虫啉产生高水平抗性的