核盘菌转录因子ss-foxe2的基因功能研究

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核盘菌转录因子Ss-FoxE2的基因功能研究ThefunctionalanalysisofthetranscriptionfactorSs-FoxE2inSclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary作者姓名：王璐专业名称：植物病理学指导教师：潘洪玉教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月1日 中文摘要核盘菌转录因子Ss-FoxE2的基因功能研究核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）是一种腐生性丝状病原真菌，它可以造成多种农作物的严重病害，从而引起重大经济损失。核盘菌的子囊盘是由菌核在合适的条件下萌发而成的圆盘状子实体，发育成熟的子囊盘将会释放子囊孢子，子囊孢子飞散到周围环境中侵染寄主植物，造成菌核病害的流行。在核盘菌基因组中存在4个Forkhead类转录因子的同源基因，分别为Ss-FoxE1、Ss-FoxE2、Ss-FoxE3和Ss-FoxE4，我们推断它们与核盘菌的有性生殖密切相关。因此，在本文中我们以Ss-FoxE2为研究对象，并对在核盘菌有性生殖中的作用进行了研究。本研究首先根据核盘菌基因组序列，克隆得到Ss-FoxE2上游890bp序列以及下游1024bp序列，将上下游序列分别连接到敲除载体pXEH上，成功构建了Ss-FoxE2的敲除载体，然后利用裂解酶消化核盘菌菌丝细胞壁，从而制备了质量较好的原生质体细胞，并用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将已构建好的敲除载体转化到核盘菌的原生质体中，以潮霉素为筛选抗性进行转化子的筛选培养，然后使用快速PCR检测方法进行初步验证，将验证正确的转化子使用Southern杂交的方法进行进一步验证。另一方面，克隆Ss-FoxE2编码基因及其上下游在内的3.4kb的片段序列，将克隆得到的序列连接到互补载体上，将构建好的互补载体转化至敲除突变体的原生质体细胞中，通过G418抗性筛选以及PCR验证得到互补成功的转化子。将Ss-FoxE2敲除突变体和Ss-FoxE2互补突变体对照野生型菌株，进行生物学特性分析和致病性分析，结果发现，Ss-FoxE2敲除突变体与野生型菌株相比，在菌丝生长速率、菌核数量、菌核干重以及致病性上几乎没有任何差别，但是，Ss-FoxE2敲除突变体不能诱导发育形成子囊盘，这说明核盘菌转录因子Ss-FoxE2参与调控核盘菌子囊盘的形成，影响核盘菌的有性生殖，这将为菌核病的防治提供新的理论基础与技术支撑。关键词：核盘菌，转录因子，Ss-FoxE2，基因敲除，子囊盘。I AbstractThefunctionalanalysisofthetranscriptionfactorSs-FoxE2inSclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBarySclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBaryisonekindoffilamentousfungiwhichcancauseavarietyofplantdiseasesandhugelossestoagriculturalproduction.ApotheciaistheveryimportantpartofS.sclerotiorumandformedfromsclerotia,undersuitableenvironmentalconditions,itcanreleaselargequantitiesofascosporesthatinitiatenewdiseasecycles.InS.sclerotiorum,therewere4Forkhead-boxtranscriptionfactorhomologousgenes,Ss-FoxE1,Ss-FoxE2,Ss-FoxE3andSs-FoxE4respectively,andweinferthattheycloselyrelatedtosexualreproductionofS.sclerotiorum.So,inthisresearch,westudiedtheroleofSs-FoxE2inS.sclerotiorum.AccordingtoS.sclerotiorumgenomesequence,890bpupstreamfragmentand1024bpdownstreamfragmentofSs-FoxE2wereclonedandligatedintopXEHrespectivelytoconstructtheknock-outvectorforSs-FoxE2.Inonehand,protoplastsofS.sclerotiorumhavebeenpreparedbyLysingdecompositionofhyphae.Theknock-outvectorforSs-FoxE2wastransformedintoprotoplastsofS.sclerotiorumandtransformantswerescreenedonPDAmediumwithhygromycinresistance,firsttransformantswereverifiedwithfastPCRprocessandsouthernblotforfurthervalidation.Intheotherhand,weclonedthewholeSs-FoxE23.4kbfragmentincludingupstreamanddownstreamsequence,thenligatedintocomplementvectorandtransformedtoS.sclerotiorumSs-FoxE2knock-outmutantprotoplast.TransformantswerescreenedonPDAmediumwithG418resistanceandverifiedbyPCRprocess.AfterphenotypeandpathogenicanalysisamongS.sclerotiorumwildtype,S.sclerotiorumSs-FoxE2knock-outmutantandcomplementmutant,wefoundthattherewasnodifferenceinhyphaegrowth,numberandweightofsclerotiaandpathogenicity,butnoapotheciaformationinSs-FoxE2knock-outmutant,thisindicatedthatSs-FoxE2hasaverysignificantroleinS.sclerotiorumII sexualreproduction,itwillprovidenewtheoreticalfoundationandtechnicalsupportforS.sclerotiorumdiseasecontrol.Keywords:Sclerotiniasclerotiorum，transcriptionfactor，Ss-FoxE2，geneknock-out，apotheciaIII 目录第一章文献综述.........................................11核盘菌简介.........................................................................................................................11.1核盘菌的分类地位..................................................................................................11.2核盘菌的生活史及其侵染循环..............................................................................11.3菌核病的症状..........................................................................................................31.4菌核病的危害及其防治..........................................................................................32核盘菌菌核的发育.............................................................................................................53核盘菌子囊盘的萌发.........................................................................................................64丝状真菌基因功能研究进展.............................................................................................73.1转座子标签技术......................................................................................................73.2RNA干扰技术........................................................................................................83.3超表达技术..............................................................................................................83.4基因敲除..................................................................................................................85Forkhead-box转录因子的研究进展.................................................................................96本研究的目的及意义.......................................................................................................10第二章核盘菌Ss-FoxE2序列分析及敲除载体的构建.........121材料...................................................................................................................................121.1实验菌株................................................................................................................121.2载体及引物............................................................................................................121.3主要试剂................................................................................................................121.4常用培养基配方及主要试剂配制方法................................................................131.5主要实验仪器........................................................................................................132方法...................................................................................................................................142.1核盘菌转录因子Ss-FoxE2上下游序列的克隆..................................................142.2敲除载体pXEH-R-L的构建及重组质粒鉴定....................................................183结果与分析.......................................................................................................................203.1Ss-FoxE2的生物信息学分析...............................................................................203.2PCR克隆核盘菌Ss-FoxE2上下游片段结果......................................................213.3重组质粒T-F2-L和T-F2-R双酶切检测结果.....................................................213.4构建重组质粒pXEH-R的检测结果....................................................................223.5构建重组质粒pXEH-R-L的检测结果................................................................234小结...................................................................................................................................24第三章核盘菌原生质体转化及敲除转化子的鉴定............251材料...................................................................................................................................251.1菌株........................................................................................................................251.2引物及序列............................................................................................................251.3主要试剂................................................................................................................251.4常用培养基配方及主要试剂配制方法................................................................261.5主要实验仪器........................................................................................................272方法...................................................................................................................................272.1核盘菌原生质体的制备........................................................................................272.2PEG-CaCl2法原生质体转化.................................................................................282.3重组转化子的抗性筛选........................................................................................282.4快速PCR法初步鉴定核盘菌转化子..................................................................292.5Southern杂交方法鉴定转化子............................................................................313结果与分析.......................................................................................................................363.1核盘菌原生质体的制备........................................................................................36I 3.2核盘菌原生质体的转化........................................................................................373.3快速PCR法初步鉴定核盘菌转化子的结果......................................................373.4Southernblotting转化子验证结果......................................................................394小结..................................................................................................................................41第四章核盘菌转录因子Ss-FoxE2的互补...................431材料...................................................................................................................................431.1实验菌株................................................................................................................431.2载体及引物............................................................................................................431.3主要试剂................................................................................................................442方法...................................................................................................................................442.1核盘菌转录因子Ss-FoxE2互补载体的构建......................................................442.2敲除菌株原生质体的制备....................................................................................472.3PEG-CaCl2法原生质体互补转化.........................................................................482.4互补转化子的抗性筛选........................................................................................482.5快速PCR法鉴定互补转化子..............................................................................483结果与分析.........................................................................................................................493.1互补转化子的转录因子Ss-FoxE2部分序列PCR验证结果.............................493.2遗传霉素G418抗性基因序列PCR验证结果....................................................503.3互补序列C-F2的PCR验证结果：....................................................................513.4互补转化子的Ss-FoxE2编码区ORF序列PCR验证结果...............................524小结...................................................................................................................................53第五章核盘菌转录因子Ss-FoxE2的功能分析..............551材料...................................................................................................................................551.1菌株........................................................................................................................551.2主要实验仪器........................................................................................................552方法...................................................................................................................................552.1菌丝生长速度测定................................................................................................552.2菌丝形态及侵染结构的观察................................................................................562.3核盘菌Ss-FoxE2突变体的致病性分析...............................................................562.4核盘菌菌核的大量培养........................................................................................562.5核盘菌子囊盘的诱导............................................................................................573结果与分析.......................................................................................................................573.1菌丝生长形态观察及生长速度测定....................................................................573.2菌丝形态显微观察................................................................................................593.3菌核数量及干重测量结果....................................................................................613.4致病性分析结果....................................................................................................623.5子囊盘的诱导结果................................................................................................634小结...................................................................................................................................65结论................................................66参考文献................................................67致谢................................................73II 第一章文献综述1核盘菌简介核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）是一种腐生性丝状病原真菌，它可以在世界范围内引起多种农作物的重要病害，从而引起重大经济损失。核盘菌寄主范围非常广泛，包括多达400多种的植物，仅在中国就有36科，214种寄主，且其寄主大多为草本植物，包括大量油料作物如油菜、大豆、花生等，[1]一些重要的园艺植物如番茄、向日葵、莴苣等，以及一些具有观赏价值的花卉[2]植物如郁金香、一品红等。并且，核盘菌几乎能够侵染植物的各个生长部位，例如：植物的根、茎、叶、花和果实，从而造成侵染部分的腐败和溃烂，引起严重的根腐病、茎腐病、叶腐病和花腐病，给农业经济造成直接重创。由于核盘菌可以形成特殊的菌核结构，而菌核可以萌发出内含多个子囊孢子的子囊盘，因此核盘菌具有非常顽强的生命力，可以适应极度恶劣的环境并长期存活。所以核盘[3]菌是当今世界上最难防治的农业植物病原真菌之一，备受世界知名专家学者的关注。1.1核盘菌的分类地位核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）是一种广泛分布于温带与亚热带的重要植物病原真菌，在分类上属于真菌门（Eumycota），子囊菌亚门（Ascomycota），盘菌纲（Discomycetes），柔膜菌目（Helotiales），核盘菌科[4]（Sclerotiniaceae），核盘菌属（Sclerotinia），长期以来被大家广泛接受的小种还包括小核盘菌（SclerotiniaminorJagger），细辛核盘菌（Sclerotinia.asari）和[5]三叶草核盘菌（SclerotiniatrifoliorumEricksson）。1.2核盘菌的生活史及其侵染循环核盘菌是一种同宗配合的兼性寄生真菌。核盘菌的整个生活史包括三种主要[6]形态：菌丝体、菌核和子囊盘。核盘菌菌丝体主要由薄壁细胞构成，细胞内有多个细胞核，胞内含隔膜，并含有许多颗粒状物质。核盘菌菌核是通过菌丝体聚[7]集而成的一种黑色如石头般坚硬的鼠粪状的特殊生物结构。菌核在核盘菌的无性发育和有性生殖中都扮演着至关重要的角色，它是一种无性结构，在核盘菌的存活、繁殖及致病过程中都发挥了非常重要的作用，根据形态学的分析，菌核是1 核盘菌的生活史中一种非常重要的休眠结构，这种休眠体可以在极端恶劣的生物和非生物环境中（包括微生物刺激、低温、干燥条件等）存活数年之久，曾有记[8]录记载说菌核能在自然界中存活8年时间。核盘菌子囊盘是由菌核在适宜的条[9]件下萌发形成的圆盘状子实体，该结构的形成是核盘菌的另一个重要特征。子囊盘发育初期呈杯状，成熟后完全展开呈圆盘状，子囊盘表面覆有子实层，子实[10]层由子囊和线性侧丝排列构成，每个子囊壳中含有8个单排列的子囊孢子，发育成熟的子囊盘将会释放子囊孢子，子囊孢子随媒介散落到周围环境中从而侵染[11]寄主植物，造成菌核病的流行。在自然条件下，核盘菌主要有两种侵染途径：一是土壤中的菌核在越冬后等到气侯及环境适合时，结束休眠并萌发出大量菌丝，菌丝体直接侵染幼嫩的寄主植株使其发病；二是结束休眠的越冬菌核，在适宜的环境条件下，萌发出子囊盘，成熟的子囊盘释放大量的子囊孢子，子囊孢子经媒介传播，散落到寄主植株的组织或器官上，并在相适的温湿度环境中萌发出菌丝继而侵染寄主植物。寄主植株的发病后期，可以看到在其茎、叶表面，腐烂果实或者茎杆中间附着着大量黑色菌核，这些菌核可以落到土壤中，安全越冬后再次萌发来侵染新的寄主植物，完成一轮侵染循环。核盘菌稳定、有效的侵染循环，使得菌核病的流行连绵不绝，生生不息。图1.1核盘菌完整生活史示意图Fig.1.1LifecycleofSclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary（fromJeffreyA.Rollins）2 1.3菌核病的症状核盘菌是一种营腐生寄生的植物病原真菌，其寄主范围非常广泛，在全世界[12]至少可以造成包括75个科、278个属在内的400多种植物的病害，其中包括具有很高经济价值的十字花科、菊科、茄科、藜科、豆科和伞形科等重要经济作[13]物，如：洋葱、花生、向日葵、油菜、郁金香、食用豆类等。核盘菌所引起的植物病害统称为菌核病，菌核病造成的不同寄主植物的病害症状是存在一些共同之处的，如患有菌核病的植物叶片表面常常形成水渍状病斑（如图1.2B），然后快速扩散到叶柄部及茎部；植物茎部发病初期也会形成水渍状病斑，后期逐步发展成黑色或灰色病斑。菌核病引起的植物病斑通常能在被侵染的坏死组织部位快速繁殖，形成松弛的白色菌丝团（如图1.2A），这是核盘菌侵染寄主植株后[14]引起病害的一个非常显著的标识。菌核病引起的早期植物病斑对植物生长并不造成影响，但随着病斑的不断扩大，整株植物的组织或器官逐渐出现枯萎、发白及坏死等症状。在植物发病后期或者在严重高温高湿环境条件下，通常会在植物组织表面或者茎杆内部形成大量黑色菌核（如图1.2D），甚至在植物开花和种子的形成部位也能产生菌核，这就是为什么我们常常可以在收获的植物种子中发[15]现一些菌核，如瓜子、扁豆、豌豆、大豆及油菜等。发病后期所形成的菌核会有一部分落入土壤中，安全越冬的菌核在次年适宜气侯环境下，复苏并萌发形成新的菌丝体或者子囊盘释放大量子囊孢子，从而继续侵染植物，所以顽强的菌核[16]是潜在的菌核病病害的主要来源。1.4菌核病的危害及其防治核盘菌所引起的各类菌核病分布广泛，几乎在世界各地都有发生，为世界农业经济造成了无可估量的损失。据统计，在美国每年有近3亿美元的经济损失是[17]由菌核病所引起的，且在上世纪90年代末曾爆发过一次最为严重的向日葵头腐病，也是由核盘菌引起的（如图1.2C），仅这一项病害造成的经济损失就已[18]达到1亿美金；在北美洲，日益严重的大豆菌核病被认为是在大豆生产中仅次[19]于大豆胞囊线虫病害的第二大病害；而在我国，核盘菌的发病情况也不容乐观，在全国各大地区频有发生，在长江流域油菜主要种植区，油菜菌核病的发生已经[20]成为制约油菜产量的主要因素；我国北方作为油料作物大豆的主产区，大豆菌核病尤为严重，因此核盘菌在我国北方危害最严重的农作物是大豆，在大豆菌核3 [21]病流行年份，菌核病所造成的农作物产量的损失最高达到60%，甚至绝产。图1.2核盘菌造成的植物病害症状及其在侵染过程中形成的经典生物结构。A：核盘菌引起大豆幼茎发病的症状并在表面形成蓬松的白色菌丝团；B：核盘菌引起蕃茄果实发病形成经典的水渍状病斑；C：核盘菌病害引起向日葵大面积枯萎及坏死；D：核盘菌侵染绿豆植株后在其茎内部形成成熟菌核；Fig.1.2ThetypicalbiologystructuresandplantssymptomscausedbyS.sclerotiorum.A:ThestemsurfaceformfluffywhitemyceliumaccumulationsymptomonSoybeanB:Thetypicalwater-soakedfruitlesionsontomato.C:ThelargeareaofsunflowerwiltingandnecroticsymptomsinfectedbyS.sclerotiorum.D:ThesclerotiaformoninfectedinsideofstemonGreenbean.鉴于菌核病在世界范围内对农作物生产所引起的严重损失，且目前还没有任何一种措施可以成功有效的对其进行防控，因此菌核病的防治依然是当代农业生产所面临的巨大难题，备受国内外专家学者的关注，关于菌核病防治的相关研究4 一直在不断前行。防治菌核病应采取以农业防治为主，结合化学防治和生物防治等方法的综合防治措施。对菌核病进行农业防治的手段主要包括：一是合理轮作，禾本科作物是核盘菌的非寄主作物，为了防治菌核病，核盘菌的寄主作物应与禾本科作物实行3年以上轮作；二是建立无病种子田，播种前及时清除种子中的菌核，挑选出具有本品种优良性状的子粒留做种用；三是清除病残体，在病田单独收获后，立即将病残植物体集中烧毁，不可任其散落田间地面，且发病田块收获后及时深翻，将土壤表面的菌核埋入至少20cm以下的土层内，由于子囊梗在土壤中得不到光照，所以不能发育形成子囊盘，以减少侵染来源；四是加强栽培管理，防止菌核萌发出土或形成子囊盘，在菌核萌发期适当铲趟，可以破坏[22]子囊盘的发育，减轻发病。实际生产中，用于化学防治核盘菌所引发病害的化学药剂，主要有多菌灵、[23]菌核净、甲基硫菌灵、农利灵及其复配剂，但由于病菌对多菌灵等常用药剂的抗药性和一些品种使用上的局限性，尤其是化学药剂可以引起严重环境污染，破坏生态平衡，药剂的残留会威胁人类健康，因此，菌核病的化学防治方法从根本上，不利于可持续农业的发展。化学防治被生物防治所代替是植物病虫害控制发展的必然方向。目前，随着绿色植保理念的畅行，以及越来越多的人对食品安全问题的关注，作物病害的生物防治方法引起了专家学者们的广泛关注。植物病害生物防治是指[24]利用有益微生物和微生物的代谢产物对作物病害进行有效防治的技术和方法。用于菌核病生物防治的生防因子有很多，包括拮抗微生物、植物诱导子和抗生素等，其中，核盘菌的重寄生真菌盾壳霉（ConiothyriumminitansCampbell）是一[25]种最具开发潜力的菌核病害生防真菌。2核盘菌菌核的发育核盘菌的一个很重要的生物学特征是菌丝特化形成菌核结构。在核盘菌的整个生活史中，菌核被认为扮演了非常重要的角色，它更是核盘菌整个生活史的重心，是核盘菌由无性发育阶段过渡到有性生殖阶段的唯一生理结构，是核盘菌可[25]以长期保持致病活力的保证，也是目前菌核病难以防控的顽疾所在。菌核的发育关乎核盘菌的整个生长发育历程，所以专家学者们在研究核盘菌的生长发育过5 程中，着重研究菌核的结构、形成和发育机制和萌发条件等，对菌核及子囊盘的[26]深入研究将会对菌核病的防治奠定坚实基础。核盘菌菌核是由营养菌丝聚集缠绕形成的一种表面呈黑褐色、质地坚硬如石[27]头般的鼠粪状生物结构。成熟菌核可以被分为三层连续的结构，从外向里依次为：表皮、皮质和髓质。随着对菌核研究的不断深入，其发育过程也被细分为6[28]个连续的不同的阶段，分别为：S0期：营养菌丝的生长期；S1期：菌核的起始发育期，这个阶段营养菌丝开始聚集；S2期：菌核积聚期，初期菌核形成；S3期：菌核增大期，菌核尺寸逐渐增大，且能观察到有大量的液体从菌核表面渗出；S4期：菌核合并期，菌核表面呈浅黄色；S5期：色素沉淀期，黑色素积累，菌核[29]表面呈黑色；S6期：菌核成熟期，即菌核发育完全成熟。图1.3核盘菌菌核的不同发育阶段Fig.1.3Thedevelopmentstagesofsclerotium.（fromDr.WenhuiMu）S1:Sclerotiuminitials.S2:Condensation.S3:Enlargement.S4:Consolidation.S5:Pigmentation.S6:Sclerotiummature.3核盘菌子囊盘的萌发除了可以产生菌核外，核盘菌的另一个重要特征是萌发出子囊盘结构，子囊盘是由菌核在适宜的条件下萌发而成的核盘菌子实体，由于其外形酷似圆盘，因[30]此被称作子囊盘，子囊盘的萌发标志着核盘菌的发育进入有性生殖阶段。子囊盘萌发初期先形成子囊梗，子囊梗是连接菌核与子囊盘的结构，在子囊盘的形成过程中，菌核中的大量营养物质将通过子囊梗传输供给给子囊盘，营养物质的消[31]耗导致菌核干重的逐渐减少。子囊盘形成初期呈细杯状，成熟后完全展开呈圆6 盘状，完全展开后的直径约为3-9mm，成熟的子囊盘表面呈黄褐色，圆盘开口[32]向上。子囊盘上表面覆有子实层，子实层由子囊和线性侧丝有序排列形成，每个子囊内含有8个单排列的子囊孢子。发育成熟的子囊盘能够释放子囊孢子到周[33]围环境中，继而侵染寄主植株，成为菌核病害流行的重要来源。根据观察，菌核的萌发也会形成一些形态变异的子囊盘，分析其主要原因可能是基因突变，或[34]受环境因素和除草剂等农药的影响所造成的畸形。图1.4核盘菌子囊盘剖面手绘示意图Fig.1.4Thehand-printedcross-sectionpictureofapothecium4丝状真菌基因功能研究进展现阶段丝状真菌基因功能研究的方法，主要包括以下几种技术：4.1转座子标签技术转座子（transposon）是一种能在基因组内跳跃移动，并对其后面基因起到[35]一定调控作用的遗传因子。丝状真菌如玉米大斑病菌、稻瘟病菌中存在着许多[36]不同种类的转座子，研究已发现约有52种转座子。转座子标签技术的基本原理是：当转座子定向插入某个功能基因后引起突变时，可以用转座子序列片段作为探针，从突变体的基因文库中钓出转座子DNA，从而获得含有部分突变体序列的片段，再以该片段为探针，从野生型基因组文库中筛选，钓到完整的目的基[37]因片段。7 4.2RNA干扰技术RNA干扰（RNAinterference，简称RNAi）技术是现在比较流行的真菌基因[38]功能的研究方法之一，RNAi技术是在RNA水平上对目的基因的表达进行干扰的，其基本原理是：在含有干扰机制的载体上，人工引入一段与目标RNA片段互补的序列，当这对互补序列在细胞内形成双链RNA（dsRNA）后，降解机制开始启动，从而抑制目标基因的表达，产生相应的功能缺陷。本实验室曲晓艳[63]硕士曾使用RNA干扰的技术来研究核盘菌转录因子Ss-MADS的基因功能。4.3超表达技术基因超表达（over-expression）的作用与RNAi恰恰相反，是将目的基因片段与其对应的启动子相连，然后一起转化到野生型菌株中，增强目的基因的表达，然后根据超表达突变体菌株的表现型，及其生理生化指标变化，来分析目的基因[39]的功能。4.4基因敲除基因敲除（Geneknock-out）技术是指利用分子生物学手段和遗传学原理，将一些序列信息已知但功能不详的基因片段，从基因组DNA中剔除，使该基因[40]的功能丧失，再根据宿主菌株所发生的功能变化，推测目的基因的功能。本研究就是利用基因敲除技术，来研究目的基因Ss-FoxE2在核盘菌中的功[41]能。基因敲除技术是以遗传学中的同源重组理论为基本原理，构建适宜同源重组的敲除载体，然后将载体质粒转化到宿主菌的细胞内，当宿主细胞发生细胞分裂时，敲除载体上的替代基因（通常是筛选抗性基因）与目的基因发生同源重组，进行连锁互换反应，使目的基因被替代基因所置换，从而达到从基因组中除去目[42]的基因的目的。在丝状真菌的遗传转化过程中，存在许多影响同源重组效率的因素，包括：同源序列的长度、同源性百分率、同源序列的G/C含量以及宿主菌的染色质结[43,44,45]构、目的基因转录情况和基因敲除所使用的遗传转化方法等。有研究表明，在酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomyces）中，长度仅为50-100bp的同源序列就可以发生同源替换，而且重组效率可达50%[46,47]-100%，而丝状真菌则需要至少1kb的同源序列，才有能满足发生同源重组8 的基本要求，且要求该同源序列与靶基因序列近100%一致，即使这些条件完全[48,49]满足，其重组效率也仅能达到10%-30%。常用的丝状真菌基因敲除的转化方法：包括根癌农杆菌介导的遗传转化法、电穿孔法、PEG/CaCl2介导的原生质体转化法、基因枪法等，且在目前的研究中，[50]上述这些方法都得到了非常成功的应用。在核盘菌的基因功能研究中，常选用PEG/CaCl2介导的原生质体转化法和农杆菌介导子囊孢子的转化法，然而这两种方法不仅转化周期长且操作繁琐，尤其是根癌农杆菌介导子囊孢子的转化法，需要收集大量的子囊孢子作为实验材料，加大了实验的难度和操作周期，而且效率低下。鉴于目前对PEG/CaCl2介导核盘菌原生质体转化法的不断的改进和优化，我们已经建立了完整的转化体系，可以在短时间内快速制备出高浓度高质量的核盘菌原生质体，并且提高了同源重组的[64]效率。本研究就是采取PEG/CaCl2介导的原生质体转化法，来进行核盘菌的敲除及互补转化。5Forkhead-box转录因子的研究进展叉头框（Forkhead-box，Fox）蛋白家族是一类DNA结合区具有翼状螺旋结[50]构的转录因子。该家族中所有蛋白所具有的共同特征是：都具有一个氨基酸数[51]目为80-100的DNA结合域，即Forkhead-box结构域。Forkhead-box结构域的核心部分由有3个α螺旋依次排列组成，两侧具有通过β侧链连接而成的两个所谓翅膀状（wing）的环状结构，因此Forkhead-box结构域又可以被称作[52]Forkhead/Wingedhelix，即Forkhead/WingedHelix型转录因子。[53]Forkhead转录因子目前已发现17个蛋白亚族，大多数Fox-box的基因研[54]究集中在人类医学的探索上。Forkhead-box蛋白家族与人类许多生物进程的调控相关，包括细胞周期调控、胚胎发育、形态特征、细胞代谢、细胞分化等。该转录因子作用时先绑定特异的DNA控制元件，再作为一个染色体结构和细胞内[55,56,57]信号转导相关的效应子发挥作用。还有研究表明，Forkhead-box蛋白家族不仅可以作为典型的转录因子，偶联其他激活因子参与调节下游基因的转录，还[58]与染色体的重排相关，同时还协同一些信号转导途径参与转录调节。目前，由于Forkhead-box蛋白家族在细胞周期调控、细胞发育、生物老化和免疫调节等生[59]物学过程中发挥作用，已成为医学领域的研究热点。9 Forkhead转录因子除了在人类医学领域的研究之外，在对某些微生物的探索中也有所发现。如酿酒酵母（S.cerevisiae）基因组中的Forkhead-box的转录因子Hcm1被发现具有调控基因转录的作用，在酿酒酵母的细胞分裂期，Forkhead-box转录因子可激活ScFKH1和ScFKH2转录因子，并与MADS-box型转录因子Mcm1p互作，共同参与调控细胞分裂的周期，决定细胞的类型和细[60]胞形态的建成，且在裂殖酵母（S.pombe）基因组中的同类转录因子Fhk2p也[61]被发现具有调节细胞分裂周期的功能。另外，在顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）基因组中的同类转录因子AcFKH1被发现与CPCR1结合，共同参与调控代谢产物头孢霉素合成途径中的至少7个关键基因；白色念珠菌（Candidaalbicans）基因组中的该类转录因子Cph1p和Efg1p也发现具有调控[62]该菌菌丝的生长及其致病性的作用。可见，Forkhead-box型转录因子在真菌的细胞分裂、生长发育、致病性等方面具有重要调控作用，且可以与其他类型的转[63]录因子互作，共同参与基因调控。通过对核盘菌T-DNA插入突变体库的筛选，我们发现Forkhead转录因子处发生T-DNA插入突变的菌株AT760的成熟菌核在诱导子囊盘发育时只能形成少量数目而且表型短小的子囊梗，不能完全发育形成子囊盘。由此我们推断，上游T-DNA的插入影响了与Forkhead蛋白家族相关的信号通路，Forkhead影响了核盘菌的有性生殖相关基因或信号途径，这暗示着核盘菌在生长与发育过程中，Forkhead-box型转录因子也应具有重要协同调控作用，值得开展深入研究。因此，我们将其命名为Ss-FoxE2转录因子。6本研究的目的及意义由于核盘菌寄主范围非常广泛，它可以在世界范围内引起多种农作物发生重要病害，从而引起重大经济损失。遗憾的是，目前没有任何一种有效且利于可持续农业发展的防治措施，菌核病害不但没有得到扼制，却还有不断蔓延加重的趋势，有效防治菌核病成为当务之急。所以，对于核盘菌的生长发育、无性及有性生殖及其致病机制等方面的探索，是十分必要的，这些研究可以作为基础信息，有助于加深我们对核盘菌的了解，更能为核盘菌的综合防治提供新的科学依据，间接的为世界粮食产业贡献力量。Forkhead-box类转录因子参与人类许多生物进程的调控，包括细胞周期、胚10 胎发育、形态特征、细胞代谢、细胞分化等。稻瘟菌中的Forkhead-box转录因子，在稻瘟菌的有性生殖中扮演了非常关键的角色，其缺失突变体菌丝生长、产孢数量、有性发育都受到了影响。但Forkhead-box类转录因子在核盘菌中的功能中却鲜为人知，鉴于该类转录因子在多种真菌的生长发育、无性及有性生殖等方面都有重要作用，所以探索其在核盘菌中的功能，可以增加人们对核盘菌的发育、生殖及发病机制等方面的了解。正如前文所述，核盘菌的菌核结构是其无性生殖与有性生殖的过渡体，在整个生命周期中发挥着非常重要的作用，农业生产中，人们通常忽视核盘菌菌核的发育周期，不能及时除去田间及种间菌核，导致其在适宜条件下萌发形成子囊盘，子囊盘释放子囊孢子，子囊孢子又作为初侵染源侵染寄主植物，从而导致菌核病的大肆流行。子囊孢子的形成与子囊盘的萌发密不可分，所以子囊盘的萌发是导致菌核病害流行的关键因素。通过现代分子生物学的手段，弄清核盘菌致病性与有性生殖中子囊盘的发育的关系，将会协助人们更好的防控菌核病。11 第二章核盘菌Ss-FoxE2序列分析及敲除载体的构建登陆BOARDinstitute，查询核盘菌基因组数据库http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/sclerotiniaSclerotiorum/MultiHome.html，通过Genesearch引擎，找到转录因子Ss-FoxE2，并确定Ss-FoxE2在基因组中的位置，从而分别获得其上下游约1000bp的片段序列。根据所获得的Ss-FoxE2上下游序列，利用primer5.0软件设计特异的PCR引物，并以核盘菌DNA为模板克隆Ss-FoxE2的上下游片段，然后将上下游片段先后连接到适于核盘菌基因敲除且带有潮霉素筛选抗性的载体pXEH上，构建核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除载体。1材料1.1实验菌株菌株：大肠杆菌E.coliDH5α；核盘菌野生型菌株UF-1，又称1980（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）（已测序菌株）1.2载体及引物载体：基因快速克隆T载体pMD18-TSampleVector（购于TaKaRa）；丝状真菌敲除载体pXEH（由pCAMBIA1300改造而成）；本实验中所用的引物见表2.1。表2.1引物及序列Tab.2.1Primersequence引物名称引物序列F2-L-FGGGTACCTAAGGAGCAGTGGGAACG（KpnI）F2-L-RGGAATTCTGCAGAAGTCATGGAGGTG（EcoRI）F2-R-FCTCTAGATTGACATCTGTTCGCAGCAC（XbaI）F2-R-RCGGATCCGCGATCCCGTTGTCTATTTG（BamHI）1.3主要试剂TaqDNApolymerase（购自天根生化公司）；限制性内切酶KpnI、EcoRI、BamHI、XbaI；T4DNAligase（以上酶产品均购自Takara公司）；Tris盐酸、氨苄12 霉素、卡那霉素、EDTA、琼脂粉、琼脂糖、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、甘油（购自鼎国公司）；NaOH、KCl、CTAB、CaCl2、MgCl2、盐酸、冰醋酸、乙酸钾、水饱和酚、SDS、氯仿、异戊醇、异丙醇、β-巯基乙醇、无水乙醇（购自北京化工公司）琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（购自天根生化科技公司）。1.4常用培养基配方及主要试剂配制方法1.4.1常用培养基（1）PDA培养基制备方法：200g去皮马铃薯切成小块，煮沸20分钟，4层纱布过滤后，定容至1L，加入20g葡萄糖，15g琼脂粉，pH自然，121℃高温高压灭菌。（2）LB培养基制备方法：l0g蛋白胨，5g酵母浸粉，10gNaCl，溶于去离子水中，调节pH至7.0（注：固体LB培养基在调节PH后，再加入2%琼脂粉），定容至1L，121℃高温高压灭菌后，贮存于4℃冰箱内，备用。1.4.2常用储备液（1）50×TAE电泳缓冲液：Tris242g，冰醋酸57.1mL，EDTA37.2g去离子水溶解后，调节pH至8.0，定容至1L后，室温储备。（2）质粒提取试剂：溶液I：50mM葡萄糖，l0mMEDTA（pH8.0），25mMTris-HCl（pH8.0）；溶液II：1％（w/v）SDS，0.2MNaOH，现用现配；溶液III：11.5mL冰醋酸，28.5mL去离子水，60mL5M的乙酸钾，配成100mL的溶液，4℃储备。（3）真菌基因组DNA提取试剂：CTAB裂解液：25mL1MTris-HCl（pH8.0），70mL5MNaCl，10mL0.5MEDTA（pH8.0），5gCTAB，溶解后定容至250mL；氯仿/异戊醇溶液：按照氯仿：异戊醇为24：1的比例充分混合。（4）大肠杆菌热击感受态制备（CaCl2法）试剂：CaCl2-MgCl2溶液：80mMMgCl2，20mMCaCl2CaCl2-甘油贮存液：100mMCaCl2，15%甘油。1.5主要实验仪器pH计；恒温摇床；恒温光照培养箱；恒温水浴锅；恒温金属浴锅；超低温13 冰箱；小型台式离心机；立式高速冷冻离心机；制冰机；PCR仪；凝胶成像系统；琼脂糖凝胶电泳仪；微量移液器。2方法2.1核盘菌转录因子Ss-FoxE2上下游序列的克隆2.1.1Ss-FoxE2上下游序列的获得搜索核盘菌基因组数据库网站，经比对分析确定转录因子Ss-FoxE2在核盘菌基因组中的位置，从而分别获得其上下游片段序列（分别命名为Leftboard，Rightboard；简称LB，RB），根据该序列，利用引物设计软件primer5.0，设计特异性PCR引物，引物见表2.1。2.1.2核盘菌基因组DNA的提取（1）核盘菌的培养在PDA平板上活化核盘菌UF-1两次，在超净工作台内用直径7mm的打孔器获得生长旺盛的核盘菌菌饼，接种到表面平铺灭菌玻璃纸的PDA平板上，倒置于25℃恒温光照培养箱中，培养2-3d（在形成菌核之前），用干净的镊子或刀片刮取玻璃纸表面的菌丝，收集在1.5mLEP管中，液氮速冻后置于-80℃冰箱中备用。（2）核盘菌基因组DNA的提取1）将收集好的菌丝,取适量放入研钵，加入液氮后迅速研磨至粉末状；2）将充分研磨的菌丝转移到1.5mLEP管中，加入600μL预热的CTAB裂解液，充分混匀，65℃恒温水浴1h，其间每隔15min翻转颠倒混匀一次，避免局部裂解不充分；3）加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），涡漩震荡至呈现均匀乳白色，12000rpm离心15min；4）吸取上清液移至新的1.5mLEP管中，重复步骤3;5）吸取上清液移至新的1.5mLEP管中，加入2倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀后置于-80℃冰箱中，沉淀30min；6）12000rpm离心15min，弃上清；7）加入1mL75%乙醇清洗沉淀，以去除多余盐离子成分，然后12000rpm离心10min，尽量吸干上清液；14 8）放入真空干燥离心机中6min至沉淀完全干燥，加入适量去离子水室温充分溶解后，置于-20℃备用。2.1.3PCR特异性扩增Ss-FoxE2上下游片段以核盘菌UF-1基因组DNA为模板，用设计好的Ss-FoxE2上下游片段特异性引物F2-L-F/F2-L-R，F2-R-F/F2-R-R分别扩增LB和RB，PCR扩增体系如下：表2.2Ss-FoxE2上下游片段PCR扩增体系Tab.2.2PCRamplificationsystemofLBandRBofSs-FoxE2成分体积（µL）10×Buffer2.5dNTP1.0模板DNA1.0引物11.0引物21.0TaqDNApolymerase（5U/µL）0.2ddH2O18.3总体积25.0PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，56℃45s，72℃70s，30个循环；72℃10min；4℃forever。PCR产物检测：制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，回收产物保存在-20℃备用。2.1.4LB、RB分别与pMD18-TVector连接将回收纯化后获得的Ss-FoxE2上游片段（LB）、下游片段（RB）分别与pMD18-T载体连接，构建重组质粒T-F2-L、T-F2-R，具体连接体系如下表所示：15 表2.3重组质粒连接体系Table2.3Ligationsystemofrecombinedplasmid成分体积（µL）回收产物4.7pMD18-T0.3SolutionILigationMix5.0总体积10.0连接反应条件如下：16℃连接仪中过夜连接。2.1.5大肠杆菌DH5α热击感受态细胞的制备（1）用接种环沾取保存于-80℃冰箱的E.coliDH5α甘油菌，在无抗性的LB平板培养基上划线，37℃培养12-16h；（2）挑取单菌落接种于含有10mLLB培养基的小三角瓶中，37℃恒温摇床中200rpm，振荡培养6-8h；（3）按照1:50的比例，将培养好的E.coli菌液加入50mLLB液体培养基中，37℃恒温摇床中200rpm，振荡培养直到OD600达到0.3-0.5之间（效果较佳）；（4）将摇好的菌液于冰上放置10min后，转移到50mL离心管中准备收集菌体；（5）4℃，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体；（6）再用50mL新鲜灭菌的LB液体培养基重新悬起菌体，去除菌体培养过程中的代谢物；（7）重复步骤5，倒置离心管1min使残留的培养基流尽；（8）加入预冷的CaCl2-MgCl2溶液30mL（每50mL初始培养物加30mLCaCl2-MgCl2溶液），轻轻吹打使菌体重悬；（9）重复步骤5，加入2mL预冷的CaCl2-甘油重悬液，重悬菌体，然后按照每管100µL的感受态细胞进行分装，液氮速冻后转入-80℃冰箱中备用。2.1.6重组质粒T-F2-L、T-F2-R的E.coliDH5α热击转化（1）在超净工作台中，将连接反应液加入（冰上解冻好的）感受态细胞中；（2）将混合液置于冰上30min，然后42℃恒温水浴锅中热击90s，热击后再冰上放置5min；16 （3）在超净工作台中，向混合液中加入800µL新鲜灭菌的LB液体培养基，37℃恒温摇床中200rpm，振荡培养45min；（4）12000rpm离心30s，留100µL上清液，重悬菌体；（5）将重悬液涂布于含筛选抗性（50μg/mL氨苄霉素抗性，即Ampr）的LB培养固体基上；（6）将涂好的平板倒置于37℃培养箱中，培养12-16h。2.1.7重组质粒T-F2-L、T-F2-R的鉴定（1）在超净工作台中，挑取筛选平板上的单菌落（若干），接种到800µL含有氨卞抗性（Ampr）的LB液体培养基中（置于1.5mLEP管内），37℃下振荡培养，4-5h后的菌液用于菌液PCR的鉴定，PCR扩增体系及条件见表2.1。制备浓度为1%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，初步鉴定可以扩增出目的条带的菌液为含阳性重组质粒的菌液。（2）将菌液PCR鉴定为阳性的重组质粒T-F2-L、T-F2-R菌液送至博仕生物公司进行DNA测序。2.1.8重组质粒T-F2-L、T-F2-R的提取（1）在超净工作台中，将测序结果正确的菌株，按照1:50的比例，接种到10mLAmprLB液体培养基中（置于25mL三角瓶内）37℃恒温摇床中振荡培养12h；（2）将菌液移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心1min，弃上清（可多次吸取离心）；（3）加入100µL溶液I，旋涡震荡，重悬菌体；（4）加入200µL（现用现配的）溶液II，上下轻轻颠倒6-8次混匀；（5）加入300µL（预冷的）溶液III，上下轻轻颠倒6-8次混匀；（6）加入600µL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），旋涡振荡混匀，12000rpm，离心15min；（7）转移上清液到新的EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，上下轻轻颠倒混匀后，置于-80℃环境中沉淀30min；（8）12000rpm离心15min，弃上清，用75%乙醇清洗沉淀，真空干燥离心6min至沉淀完全干燥，加入30µL去离子水溶解，储备于-20℃冰箱中。17 2.2敲除载体pXEH-R-L的构建及重组质粒鉴定构建策略：如图2.1所示，先连接下游片段RB，再连接上游片段LB。MCSofpXEHLeftBoard890bpRightBoard1024bp图2.1敲除载体pXEH-R-L构建策略图示Fig.2.1Knock-outvectorpXEH-R-Lconstructionstrategy（1）用与RB扩增引物酶切位点相对应的限制性内切酶BamHI和XbaI消化经测序确认正确的重组质粒T-F2-R及载体质粒pXEH，酶切体系见表1.5；琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段RB，及酶切后线性化载体片段pXEH；将纯化的目的片段RB与线性pXEH片段在16℃条件下连接，以构建重组质粒pXEH-R，连接体系见表1.6；重组质粒pXEH-R热击转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于含筛选抗性（50μg/mL卡那霉素抗性，r即Kana）的LB培养固体基上，37℃环境培养16-20小时后；挑取若干单菌落，r接种到Kana筛选抗性的液体LB培养基中，于37℃摇床中震荡培养4-5h，进行18 菌液PCR验证，该菌液PCR扩增体系参考表1.2，挑取电泳检测为阳性的菌株进行扩大培养，同时吸取适量菌液送至博仕生物公司进行DNA测序，测序确保连接无误后提取重组质粒pXEH-R。表2.5质粒酶切反应体系Tab.2.5Restrictionenzymedigestionsystemofplasmid成分体积（µL）10×buffer5.0酶11.5酶21.5重组质粒15.0ddH2O27.0总体积50.0表2.6重组质粒连接体系Tab.2.6Ligationsystemofrecombinedplasmid成分体积（µL）目的片段4.7线性载体片段0.3SolutionILigationMix5.0总体积10.0（2）用与LB扩增引物酶切位点相对应的限制性内切酶KpnI和EcoRI消化重组质粒T-F2-L及已经连接上RB的重组质粒pXEH-R（酶切体系见表1.5），电泳检测后回收纯化目的片段LB及线性化pXEH-R片段；目的片段LB与线性化pXEH-R片段在16℃条件下催化连接，以构建重组质粒pXEH-R-L（连接体系见表1.6）；重组质粒pXEH-R-L转化筛选后，进行菌液PCR验证（体系参考表1.2）和DNA测序。验证连接正确后，用质粒小提试剂盒提取大量pXEH-R-L质粒，重组质粒pXEH-R-L即核盘菌转录因子Ss-FoxE2的基因敲除载体，将转化19 到核盘菌原质生体中。3结果与分析3.1Ss-FoxE2的生物信息学分析对核盘菌基因组中的转录因子编码基因Ss-FoxE2进行生物信息学分析：该基因全长这1409bp，其中包含62bp内含子，其编码区开放阅读框ORF可以编码449个氨基酸；在NCBI数据库中对Ss-FoxE2编码的蛋白质进行分析，通过蛋白质结构域及功能预测，发现其为一个具有保守DNA绑定位点的DNA结构域，其结构特征符合Fork-headbox转录因子的特点。图2.2Ss-FoxE2在核盘菌基因组中基本信息Fig.2.2ThebasicbioinformaticinformationofSs-FoxE2inS.sclerotioeum.20 3.2PCR克隆核盘菌Ss-FoxE2上下游片段结果以核盘菌UF-1基因组DNA为模板，分别以F2-L-F/F2-L-R；F2-R-F/F2-R-R为引物，对核盘菌转录因子Ss-FoxE2上下游片段（LB长度为890bp，Rb长度为1024bp）进行PCR扩增，扩增结果如图1.2。图2.3上下游片段LB和RBPCR扩增电泳检测结果1,2:大小为890bp的上游片段LB；3,4:大小为1024bp的下游片段RB；M：250bpDNAladderMarkerFig.2.3PCRamplificationdetectionofLBandRBfragment1.2:LBfragment890bp;3.4:RBfragment1024bp.M:250bpDNAladderMarker3.3重组质粒T-F2-L和T-F2-R双酶切检测结果重组质粒T-F2-L和T-F2-R经其分别对应的两个限制性内切酶消化后，得到两端带有特异性酶切位点的目的片段LB和RB，双酶切检测结果如图1.3，1.4。回收纯化目的片段后，与敲除载体pXEH连接。21 图2.4重组质粒T-F2-L的双酶切电泳检测结果1,2,3,4,5,6,7:890bp的双酶切片段LB;M:250bpDNAladderMarkerFig.2.4PlasmidT-F2-Ldoubledigestdetection1,2,3,4,5,6,7:890bpLBdoubledigestfragment;M:250bpDNAladderMarker图2.5重组质粒T-F2-R的双酶切电泳检测结果1,2,3,4,5:1024bp的双酶切片段RB;M:250bpDNAladderMarkerFig.2.5PlasmidT-F2-Rdoubledigestdetection1,2,3,4,5:1024bpRBdoubledigestfragment;M:250bpDNAladderMarker3.4构建重组质粒pXEH-R的检测结果回收纯化的RB片段与线性化的质粒pXEH连夜转化，形成重组质粒pXEH-R，其PCR检测结果如图1.5，重组质粒pXEH-R可以扩增到大小为1024bp的RB片段，且pXEH-R质粒长度较pXEH相比也有加大，其质粒长度大小比较22 电泳结果如图1.6，两种结果均可证明片段RB已经特异性连接到载体pXEH上，形成重组质粒pXEH-R。图2.6重组质粒pXEH-R的PCR扩增RB电泳检测结果1,2:pXEH-R质粒PCR扩增RB片段;M:MarkerFig.2.61024bpfragmentRBbyPCRdetectionfromtheplasmidpXEH-R;1,2:PCRproduct1024bpfragmentRBfromplasmidpXEH-R;M:250Marker图2.7重组质粒pXEH-R与对照质粒pXEH的长度比较电泳检测结果C：对照质粒pXEH；1,2,3：质粒pXEH-RFig.2.7PlasmidpXEH-RandthecontrolplasmidpXEHC：ThecontrolplasmidpXEH；1,2,3：PlasmidpXEH-R3.5构建重组质粒pXEH-R-L的检测结果回收纯化的LB片段与线性化的质粒pXEH-R连接转化，形成重组质粒pXEH-R-L，其PCR检测结果为：重组质粒pXEH-R-L可以扩增到LB片段，且pXEH-R-L质粒长度较pXEH-R相比也有加大，其质粒长度大小比较电泳结果如图2.8，两种结果均可证明片段LB已经特异性连接到载体pXEH上，形成重组质粒pXEH-R-L，与生物公司测序结果相吻合。23 图2.8重组质粒pXEH-R-L与对照质粒pXEH-R的长度比较电泳检测结果1,2,3：质粒pXEH-R-L;C：对照质粒pXEH-R；Fig.2.8PlasmidpXEH-R-LandthecontrolplasmidpXEH-R1,2,3：PlasmidpXEH-R;C：ThecontrolplasmidpXEH；4小结本章节中，我们成功提取了核盘菌UF-1基因组总DNA，并以其为模板，利用PCR技术特异性扩增克隆了核盘菌转录因子Ss-FoxE2的大小为890bp上游片段LB和大小为1024bp的下游片段RB。将LB，RB分别连接快速克隆T载体pMD18-T，得到重组质粒T-F2-L和T-F2-R，将测序成功的重组质粒T-F2-L和T-F2-R与适用于丝状真菌的基因敲除载体pXEH利用基因工程的技术，成功构建了核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除载体pXEH-R-L。本章节实验是后续核盘菌遗传转化实验的前提和基础，完全符合真菌基因敲除研究同源重组的原理。针对该基因设计的敲除载体pXEH-R-L，经转化进入核盘菌基因组后，以其真菌的潮霉性抗性基因片段替换掉基因组中的Ss-FoxE2片段，以达到基因敲除的目的。所以，构建敲除载体是同源重组过程中必要的实验步骤。24 第三章核盘菌原生质体转化及敲除转化子的鉴定为了研究核盘菌转录因子Ss-FoxE2在核盘菌中的功能，我们将采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化的方法，将成功构建的敲除载体pXEH-R-L质粒转化到核盘菌菌株UF-1的原生质体中，旨在发生同源重组后，敲除载体中的潮霉素抗性基因片段替换掉基因组中的Ss-FoxE2片段，以达到基因敲除的目的。通过含潮霉素PDA培养基的选择培养，筛选得到一定数量转化子，并使用PCR及southern杂交的方法对这些转化子进行验证。1材料1.1菌株菌株：核盘菌野生型菌株UF-1（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）1.2引物及序列本实验中所用的引物见表3.1。表3.1引物及序列Tab.3.1Primersequence引物名称引物序列F2-FCTTTGATGACGGGACTGTF2-RATGCTCCGAGGAAGATGGH1CGTCTGCTGCTCCATACAAGH2GCGAAGAATCTCGTGCTTTCHpt-aATGATGCAGCTTGGGCGCAHpt-bACAGACGTCGCGGTGAGTTCA1.3主要试剂TaqDNApolymerase，dNTP（购自天根生化公司），限制性内切酶XhoI、BamHI，以上试剂均购自大连Takara公司。罗氏地高辛（DIG）标记与检测试剂盒购于长春百奥生物有限公司。Lysing酶购于thermos公司。Tris、SDS、琼脂粉、PEG4000、D-山梨醇、柠檬酸钠、酵母浸粉、马来酸等购于长春鼎国公司。25 CaCl2、KCl、蔗糖、无水乙醇，NaOH、MgSO4、DMSO、肝素钠等购于北京化工公司。1.4常用培养基配方及主要试剂配制方法1.4.1常用培养基（1）YPSU培养基制备方法：4g酵母浸粉，1gK2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，15g蔗糖，溶于去离子水中，调节pH至6.5，定容至1L，121℃高温高压灭菌后，贮存于4℃冰箱内，备用。（2）RM上层培养基：23.96g蔗糖，0.05g酵母提取物，0.8g琼脂粉，去离子水溶解后，定容至100mL，121℃高温高压灭菌。（3）RM下层培养基：239.6g蔗糖，0.5g酵母提取物，15g琼脂粉，去离子水溶解后，定容至1L，121℃高温高压灭菌。1.4.2核盘菌原生质体制备缓冲夜（1）Protoplastbuffer：0.8MMgSO4·7H2O，0.2M柠檬酸钠，去离子水溶解后，调解pH至5.5，121℃高温高压灭菌，室温储备；（2）Novozymebuffer：1MD-山梨醇，50mM柠檬酸钠，去离子水溶解后，调解pH至5.8，121℃高温高压灭菌，室温储备；（3）STC：1MD-山梨醇，50mMTris（pH8.0），50mMCaCl2·2H2O，去离子水溶解后，121℃高温高压灭菌，室温储备；（4）KTC：1.8MKCl，150mMTris（pH8.0），150mMCaCl2，去离子水溶解后，121℃高温高压灭菌，室温储备；（5）PEG溶液：称取适量PEG4000粉末，溶于去离子水中，制成终浓度60%的PEG溶液，121℃高温高压灭菌，室温储备；（6）KCl溶液：0.6MKCl，去离子水溶解后，121℃高温高压灭菌，室温储备。1.4.3Southern杂交缓冲液（1）HCl溶液：浓盐酸溶于水中制成终浓度为0.25M的溶解，室温储备；（2）碱性转移缓冲液：0.8MNaCl，0.4MNaOH，室温储备；（3）马来酸缓冲液（Maleicacidbuffer）:0.1MMaleicacid；0.15MNaCl，用固体NaOH调节pH至7.5，121℃高温高压灭菌，室温储备；26 （4）洗涤缓冲液（Washingbuffer）：马来酸缓冲液加入0.3%Tween20（v/v），121℃高温高压灭菌，室温储备；（5）检测缓冲液（DetectionBuffer）：0.1Tris-HCl；0.1MNaCl，用HCl调节pH至9.5，121℃高温高压灭菌，室温储备；（6）阻断液（Blockingsolution）：用Maleicacidbuffer将Blockingregentsolution（管6）稀释10倍（现用现配）；（7）抗体溶液：用Blockingsolution将Anti-Digoxigenin-AP（ADAP，管4）稀释20倍（现用现配）；（8）20×SSC溶液（salinesodiumcitrate）：175.32gNaCl；88.2g柠檬酸三钠，去离子水溶解后，固体NaOH调节pH至7.0，定容至1L，121℃高温高压灭菌，室温储备；（9）洗液I：1×SSC，1%SDS（SDS母液抽滤灭菌）；（10）洗液II：0.5×SSC，0.1%SDS；（11）底物显色液：取200ulNBT/BCIP（5号管）加入10mlDetectionBuffer。1.5主要实验仪器超净工作台；通风橱；-80℃低温冰箱；制冰机；光照培养箱；分析天平；高压灭菌锅；金属浴；恒温水浴锅；低温离心机；PCR仪；PH计；磁力搅拌器；分子杂交炉；琼脂糖凝胶电泳仪；凝胶成像系统。2方法2.1核盘菌原生质体的制备（1）在PDA平板上活化培养野生型核盘菌UF-1两次，用直径为7mm的打孔器在菌丝生长边缘打孔，将菌饼正面朝上接种到装有15mlYPSu液体培养基的培养皿中，每皿接3块菌饼，室温培养2-3天；（2）在超净工作台中，用灭过菌的镊子夹取菌丝体，先用大量无菌水冲洗，再用适量原生质体缓冲液清洗，充分清洗后，用灭过菌的滤纸吸干多余缓冲液，然后用镊子撕成均匀的小块儿，转移至容积为125mL的三角瓶中；（3）称量600mgLysing酶粉末，溶解于9mLNovozymebuffer中，抽滤除菌后，全部移至装有菌丝块的三角瓶中，再加入17mL原生质体缓冲液；27 （4）将封好口的小三角瓶遮光处理后，在28℃恒温摇床中，150rpm震荡酶解2-4小时，一般3小时左右就可以镜检；（5）镜检确认酶解充分后，用灭过菌的铺有3层玻璃棉（擦镜纸）的漏斗过滤原生质体裂解液，收集于已灭菌的250mL离心瓶中；（6）向离心瓶中加入30mL0.6MKCl溶液，5000rpm，4℃离心10min后，弃上清，收集原生质体；（7）用20mLSTC缓冲液轻轻重悬沉淀，5000rpm，4℃离心10min；（8）重复步骤7（9）取1mLSTC缓冲液悬浮原生质体，镜检后确认原生质体浓度至少达到1×108个/mL，如浓度过大，可再用STC缓冲液稀释；2.2PEG-CaCl2法原生质体转化（1）取50µL刚刚制备好的原生质体STC悬浮液，加入15µL冰浴过的敲除载体重组质粒pXEH-R-L，轻轻混合后，于冰上静置30min；（2）向上述转化预混液中加入1mL60%PEG溶液，上下轻轻颠倒若干下混匀，室温静置20min；（3）将上述PEG混合液滴在RM培养基平板上，轻轻倾斜使其覆盖于整个培养基表面，正置于室温条件下，黑暗培养15小时（注：RM培养基需定量，每皿含下层培养基25mL，上层培养基为10mL，且含浓度为50mg/mL的潮霉素700µL）（4）次日，向培养皿倒入10mL微热的含潮霉素的RM上层培养基（最终每皿共含35mL的RM培养基和3.5mg的潮霉素，使其潮霉素在培养基中的终浓度为100µg/mL）；（5）待上层培养基凝固后，于室温放置培养，5-7天后可在显微镜下观察，9-11天后，肉眼可见重新长出的白色单个核盘菌菌落。2.3重组转化子的抗性筛选在超净工作台中，将平板上陆续长出的核盘菌单菌落编号，并用灭过菌的刀片切取菌丝顶端，接种含潮霉素的PDA培养基（浓度100µg/mL）上进行抗性筛选培养，每次筛选需培养2-3天，总共进行3次筛选，最终获得对潮霉素抗性稳定的转化子菌落。28 2.4快速PCR法初步鉴定核盘菌转化子2.4.1快速PCR方法（1）用5mm打孔器在培养2-3天的核盘菌野生型或突变体PDA平板上，选取菌丝边缘位置打孔制备菌饼；（2）取3个菌饼置于1.5mL的离心管中，液氮速冻后置于-80℃冰箱中过夜裂解；（3）次日，吸取300µL0.5M的NaOH溶液加入含有菌饼的离心管中，12000rpm离心10min;（4）吸取5µL上清液加入到一个新的EP管中，并加入45µL100mMTris-HCl（pH8.0）溶液，充分混匀；（5）取上述溶液1µL做为PCR反应的模板，立即进行PCR分析。2.4.2转化子转录因子Ss-FoxE2部分序列PCR验证选取核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列，大小为712bp，利用primer5.0设计其特异性扩增引物F2-F/F2-R，并用该引物F2-F/F2-R进行快速PCR克隆验证，其验证示意如图3.1：712bp图3.1Ss-FoxE2部分序列快速PCR验证示意图Fig.3.1DiagramofverificationofSs-FoxE2partialsequence29 PCR反应体系如表3.1：表3.1快速PCR验证Ss-FoxE2部分序列体系Tab.3.1SystemofPCRverificationofSs-FoxE2partialsequence成分体积（µL）10×Buffer2.5dNTP1模板DNA1引物11引物21TaqDNApolymerase（5U/µl）0.2ddH2O18.3总体积25PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。2.4.3部分潮霉素抗性基因序列验证在潮霉素基因编码区开放阅读框ORF内部选取一段大小为650bp的序列，利用primer5.0软件设计引物H1/H2，并用该引物H1/H2进行快速PCR克隆验证，其验证示意如图3.2：图3.2部分潮霉素抗性基因序列验证示意图Fig.3.2DiagramofverificationofhygresistancegenepartialsequencePCR反应体系参考表3.1，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，56℃45s，72℃50s，30个循环；72℃10min；4℃forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。2.4.4Ss-FoxE2上游片段+部分潮霉素基因验证使用Ss-FoxE2上游片段引物F2-L-F作为上游引物，利用primer5.0软件设30 计潮霉素基因的引物Hpt-b作为下游引物，对Ss-FoxE2上游片段+部分潮霉素基因进行验证，同样道理使用Ss-FoxE2下游片段的下游引物F2-R-R作为下游引物，设计潮霉素基因的引物Hpt-a作为上游引物，对Ss-FoxE2下游片段+部分潮霉素基因进行验证。验证示意图如下所示：图3.3Ss-FoxE2上下游片段+部分hyg基因示意图Fig.3.3DiagramofcloningupstreamanddownstreamfragmentandhygresistancegenepartialsequencePCR反应体系参考表3.1，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。2.5Southern杂交方法鉴定转化子2.5.1转化子及野生型核盘菌UF-1的DNA的提取利用CTAB法提取野生型核盘菌UF-1及转化子基因组DNA，具体步骤请参见第二章2.1.2。2.5.2探针的制备（1）Probe1：选取核盘菌转录因子Ss-FoxE2内部一段712bp的序列作为probe1进行扩增，使用特异扩增引物F2-F/F2-R，进行PCR扩增，PCR反应体系参考表3.1，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃forever。制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，回收产物保存在-20℃环境下备用。（2）Probe2：选取潮霉素抗性基因序列内部一段大小为646bp的序列作为probe2进行克31 隆，使用特异扩增引物H1/H2，进行PCR扩增，PCR反应体系参考表3.1，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，56℃45s，72℃50s，30个循环；72℃10min；4℃forever。制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，回收产物保存在-20℃环境下备用。2.5..3探针标记（1）纯化后的Probe1和Probe2片段，使用紫外可见分光光度计进行核酸定量，分别计算其浓度，然后各吸取3µg的Probe1和Probe2片段，分别置于干净的离心管中，补充去离子水至体积为16µL；（2）将离心管封口后进行沸水浴10min，使其充分变性，然后立刻置于冰上冷却；（3）加入4µLMix-Dig-Highprimer（管1），充分混合后在37℃恒温水浴锅，反应过夜；（4）次日，65℃金属浴10min终止标记反应，将标记好的探针保存在-20℃备用。2.5.4基因组DNA酶切将野生型核盘菌UF-1基因组DNA及转化子基因组DNA分别使用限制性内切酶EcoRI、XhoI进行双酶切消化反应，具体酶切体系见表3.2：表3.2基因组DNA酶切体系Tab.3.2SystemofenzymedigestionofgenomeDNA成分体积（µL）基因组DNA50.0EcoRI3.0XhoI4.510×Hbuffer10.0ddH2O32.5总体积100.037℃环境下酶切12-16h。反应结束后，取3µL酶切产物进行电泳检测基因组DNA是否被消化完全，若消化不完全，则需补充适量内切酶并延长反应时间；32 若消化完全，则终止酶切反应，进行下一步实验。2.5.5电泳及印迹转膜（1）电泳：制备浓度为1.8%的琼脂糖凝胶，将酶切产物及对照样品进行电泳检测；（2）切胶：用刀片切去样品孔道周围多余的琼脂糖凝胶，使含样品的胶的面积尽量小，同时测量胶的长和宽，并在胶的右上角切出“三角形”作为区别正反面的标记；（3）脱嘌呤反应：将切好的胶块置于含适量0.25MHCl溶液的托盘中，振荡漂洗直至溴酚蓝变黄，可脱去DNA分子上的嘌呤碱基，使DNA片段更容易转移到尼龙膜上。（4）洗涤：脱嘌呤结束后，倒掉HCl溶液，胶块用蒸馏水漂洗2次；（5）转膜：向托盘内加入大量变性液，搭上宽于胶块长度的滤纸桥（两张滤纸）；充分湿润后，将胶块正放在滤纸桥上，然后根据测量的胶块尺寸，剪一块长宽都略小于胶块的尼龙膜，并在膜的右上角切出“三角形”作为区别正反面的标记；将剪好的尼龙膜在变性液中浸润，然后公整地平铺在胶块上，用湿润的玻璃棒赶走气泡，再在膜上平铺两张与膜相同尺寸的滤纸，确保各层之间都没有气泡（气泡会造成该处的DNA片段不能被转移，或转移不充分，条带扭曲）；在滤纸上放置一打略小于尼龙膜尺寸的吸水纸（以避免吸水纸直接与滤纸桥接触，造成“短路”），并在最上面放置重约0.5kg重物，且要保证施力均匀，转膜过程需要经常更换干的吸水纸，以维持转膜作用力，一般转膜过程需要进行12-14h；转膜详细图解为图3.4。33 图3.4SouthernBlotting转膜过程图解Fig.3.4DiagramofSouthernBlottingmembraneprocess（6）固定：用适量2×SSC溶液洗涤尼龙膜，然后用滤纸吸干，紫外交联仪下固定DNA（5000µJ/cm2，5min）。2.5.6杂交（1）预杂交：将膜浸泡在2×SSC中后，用镊子轻轻夹取尼龙膜，将其转移至杂交管中，膜正面向里，并向杂交管内加入适量（使膜在管内能够自由移动）37℃预热的DIGEasyHyb（管7），在42℃杂交炉中以15rpm的速率预杂交4小时（新膜预杂交时间较长）；预杂交可以封闭尼龙膜上的非特异性杂交位点，降低背景噪点；（2）探针变性：将探针进行10min沸水浴，使其充分变性，然后立即置于冰上冷却，防止复性；（3）杂交：将预变性液排尽，加入新的预热的DIGEasyHyb（管7）和变性的探针，在42℃杂交炉中以15rpm的速率杂交过夜。2.5.7洗膜及免疫检测（化学显色法）（1）回收杂交管中的杂交液，向托盘中倒入适量洗液I，65℃水浴摇床上洗34 膜2次，每次15min；（2）倒掉洗液I，加入适量洗液II，再次65℃水浴摇床洗膜2次，每次15min；（3）倒掉洗液II，加入适量Washingbuffer，常温摇床上轻轻漂洗5min；（4）倒掉Washingbuffer，将膜轻轻转移至杂交管中，加入20mlblockingsolution（现用现配），在杂交炉中室温反应30min；（5）倒掉blockingsolution，加入20mLantibodysolution，在杂交炉中室温反应30min；（6）倒掉anibodysolution，加入20mL的washingbuffer，室温漂洗2次，每次进行15min；（7）倒掉Washingbuffer，加入20mLdetectionbuffer，室温平衡5min；（8）将膜移至于一个合适容积的容器中，向膜表面滴加10mL底物显色液（现用现配），使显色液均匀覆盖于整个膜面且保证无气泡产生，室温环境下静置避光孵育；（9）反应数分钟后即可显色，若显色不明显，则需适当延长显色时间（一般16h后已完全显色），显色间隙可迅速打开避光容器观察结果；（10）显色结束后，用适量TE缓冲液充分洗膜，拍照或扫描保存实验结果。2.5.8洗脱探针及重探（1）向托盘内加入适量二甲基甲酰胺（DMF），将膜移至托盘中，将托盘放入60℃水浴摇床中，轻轻摇动漂洗掉已经结合在膜上的探针和显色的色素，直至膜表面干净没有颜色（注意：当温度达到67℃时，DMF易自燃）；（2）用大量无菌去离子水充分洗膜；（3）向干净托盘中加入适量含有0.1%SDS的0.2MNaOH溶液，37℃水浴摇床上振荡洗膜两次，每次15min；（4）将膜移至杂交管，并加入适量2×SSC溶液，使膜平衡5min；（5）使用第二种探针，重复上述预杂交和杂交步骤，在同一张膜上进行重探。35 3结果与分析3.1核盘菌原生质体的制备在PDA平板上活化两次野生型核盘菌UF-1后，将含生长旺盛菌丝的菌饼正面朝上接种到装有15mLYPSu液体培养基的培养皿中，每皿接3块菌饼，室温培养2-3天，收集菌丝，收集时菌丝体生长情况如图3.5所示：图3.5野生型核盘菌菌丝的培养Fig.3.5Cultivationofwild-typeSclerotiniahyphae清洗过的菌丝，撕成小块，加入抽滤灭菌的Lysing酶液，经过2-4h的酶解后显微镜下检测，利用血球计数板计数，并加入适量STC溶液调节原生质体细8胞的浓度，使该浓度至少能达到1×10个/mL，显微检测结果如图3.6所示：图3.6核盘菌原生质体显微图片Fig.3.6MicrographofSclerotiniaprotoplastA:原生质体稀释10倍后镜检；B:原生质体稀释50倍后镜检-1-21:Protoplastcellsdilutedto10；2:Protoplastcellsdilutedto2×1036 根据显微镜检结果及血球计数板计数结果可以确定，实验制备了质量合格且浓8度可达到5.6×10个/mL的核盘菌原生质体，完全可以覆盖同源重组发生的概率，即该原生质体能够满足敲除转化的需求。3.2核盘菌原生质体的转化采用PEG-CaCl2原生质体转化的方法，将构建好的敲除载体重组质粒pXEH-R-L转化到野生型核盘菌原生质体中，敲除载体与野生型核盘菌基因组DNA发生同源重组，即敲除载体质粒pXEH-R-L上连接的LB和RB片段与基因组DNA上的LB和RB片段同源，发生同源重组后，敲除载体上的潮霉素基因片段将会替换掉核盘菌转录因子Ss-FoxE2片段，从而达到敲除Ss-FoxE2的目的。同源重组敲除基因的过程示意图如图3.7：图3.7同源重组示意图Fig.3.7Diagramofhomologousrecombination通过原生质体遗传转化，及3次潮霉素抗性筛选培养，一共得到了15个转化子，即核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体。3.3快速PCR法初步鉴定核盘菌转化子的结果3.3.1转化子转录因子Ss-FoxE2部分序列PCR验证结果选取核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列大小为712bp进行克隆，如果该转化子为阳性，那么快速PCR将不能检测到大小为712bp的目的基因片段的存在。PCR检测结果如图3.8所示：37 712bp图3.8核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列验证结果Fig.3.8PCRverificationoftranscriptionfactorSs-FoxE21-13:1-1；1-4；2-3；2-4；4-1；4-2;4-3;5-1;5-2;5-3;6-1;7-1;9-1转化子Ss-FoxE2的克隆结果；A:质粒对照B:野生型核盘菌对照1-13:CloneSs-FoxE2genesequenceoftransformants1-1；1-4；2-3；2-4；4-1；4-2;4-3;5-1;5-2;5-3;6-1;7-1;9-1；A:Plasmidcontrol；B:Wild-typecontrol图3.8所示结果为：2，4，8，9，10，12号泳道与对照B泳道没有条带，则可初步证明其对应的转化子1-4，2-4，5-1，5-2，5-3，7-1是阳性转化子。3.3.2部分潮霉素基因序列验证结果在潮霉素基因编码区开放阅读框ORF内部选取一段大小约650bp的序列，如果潮霉素基因替换了核盘菌基因组中的Ss-FoxE2基因，那么PCR反应将会检测到该650bp的片段。以上一步所筛选出的阳性转化子DNA为模板，继续进行快速PCR检测。PCR检测结果如图3.9所示650bp图3.9部分潮霉素抗性基因序列的验证结果1-6:转化子1-4;2-4;5-1；5-2;5-3;7-1潮霉素基因的克隆结果A:Plasmidcontrol;B:Wild-typeFig.3.9PCRverificationofthepartialsequenceofhygromycinresistancegene1-6:Clonehygromycingeneoftransformants1-4；2-4；5-1；5-2；5-3；7-1A:Plasmidcontrol；B:Wild-typecontrol;38 图3.9所示结果为：2，3，4，5，6号泳道与对照A均有条带，则说明其对应的转化子2-4，5-1，5-2，5-3，7-1是阳性转化子。3.3.3Ss-FoxE2上游片段+部分潮霉素抗性基因验证结果如果潮霉素基因在正确位置替换了核盘菌基因组中的Ss-FoxE2基因，那么PCR反应将会检测到LB+hyg和RB+hyg分别为1200bp和1300bp大小的片段。以上一步所筛选出的阳性转化子DNA为模板，继续快速PCR检测。图3.10Ss-FoxE2上下游片段-部分潮霉素抗性基因序列验证结果Fig.3.10PCRverificationoftheLB+hyg，RB+hyg1-6:转化子1-4;2-4;5-1；5-2;5-3;7-1Ss-FoxE2上下游片段-部分潮霉素抗性基因序列验证结果;A:质粒对照；B:野生型核盘菌对照1-6:PCRVerificationoftheLB+hyg，RB+hygfromtransformants1-4;2-4;5-1；5-2;5-3;7-1A:Plasmidcontrol；B:Wild-typecontrol图3.10所示结果为：在LB+hyg快速PCR条带检测中2和3号泳道与对照A均有条带，在RB+hygPCR条带检测中2，3以及5号泳道与对照A有条带，所以2和3号泳道对应的转化子2-4，5-1号是阳性转化子。但因目的条带均比较微弱，不如对照A明显，所以只能作为初步确认，进一步确认还需要进行Southernboltting实验来证明。3.4Southernblotting转化子验证结果根据快速PCR对转化子的转录因子Ss-FoxE2部分序列、潮霉素抗性基因部分序列，以及Ss-FoxE2上下游片段至部分潮霉素抗性基因序列4方面的初步验证结果，我们可以初步认定2-4和5-1号转化子有可能是核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体。但是鉴于快速PCR结果的不稳定性和高假阳性，故我们对2-4和5-1号转化子进行Southernblotting鉴定。39 本实验使用两种不同的探针，分别为probe1和probe2进行杂交验证：Probe1是以核盘菌转录因子Ss-FoxE2基因内部的一段序列作为探针，如果2-4和5-1号转化子确实是转录因子Ss-FoxE2敲除突变体，则转化子基因组DNA中就不存在能与Probe1杂交的相应片段，那么就不能检测到与野生型核盘菌对照相同的目的条带；反之如果该基因未被敲除，那么通过杂交检测会出现与野生型对照相同的目的条带。Probe2是以潮霉素抗性基因序列内部的一段序列作为探针，如果2-4和5-1号转化子内确实发生了同源重组，那么转录因子Ss-FoxE2基因序列将被替换成潮霉素抗性基因序列，在转化子基因组DNA中，Probe2能够与相应的片段杂交，则通过杂交后会检测到与敲除载体质粒pXEH-R-L对照相同的目的条带。反之该基因未被敲除，即Ss-FoxE2基因序列未被替换成潮霉素抗性基因序列，则不会出现相应目的条带。用以上两种探针先后进行southern杂交实验后，杂交结果如图3.11和3.12所示：图3.11Ss-FoxE2部分序列作为probe1杂交检测结果Fig.3.1Southernblottinganalysiswithprobe1WT:野生型核盘菌；V:敲除载体质体；KO.2:2-4号转化子；KO.5：5-1号转化子W:Wild-type；V：knock-outvector；KO.2:transformant2-4；KO.5:transformant5-1Ss-FoxE2部分序列作为probe1杂交检测结果显示：以只有WT野生型核盘菌对照出现条带，敲除质粒对照与转化子2-4；5-1基因组均没有条带，说明转化子2-4；5-1为阳性转化子，转录因子基因Ss-FoxE2确实被敲除掉。40 图3.12Hyg抗性基因部分序列作为probe2杂交检测结果Fig.3.12Southernblottinganalysiswithprobe2WT:野生型核盘菌；V:敲除载体质体；KO.2:2-4号转化子；KO.5：5-1号转化子W:Wild-type；V:knock-outvector；KO.2:transformant2-4；KO.5:transformant5-1潮霉素抗性基因部分序列作为probe2杂交检测结果显示：敲除载体质粒对照与转化子2-4，5-1基因组均出现条带，而WT野生型核盘菌对照未出现条带，说明转化子2-4和5-1内部确实发生同源重组，Ss-FoxE2被替换成潮霉素基因，进一步说明转化子2-4和5-1为阳性转化子，即核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体。因此，我们命名转化子2-4一5-1分别为核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体KO.2和核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体KO.5（KO是knock-out的缩写）。4小结本研究中，我们利用了核盘菌细胞壁裂解酶Lysing来处理核盘菌菌团，制备了质量和浓度符合要求的核盘菌原生质体，通过PEG-CaCl2法原生质体遗传转化的方法将事先构建好的核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除载体pXEH-R-L质粒转化到野生型核盘菌的原生质体细胞中，基于上下游序列的高度同源性，敲除载体上的潮霉素抗性基因序列与野生型核盘菌基因组中的Ss-FoxE2发生了同源重组替换，整合到野生型核盘菌的基因组DNA中，因此本实验初步获得了15个具有潮霉素筛选抗性的敲除转化子。从4个方面进行快速PCR验证转化子是否为阳性，分别为：1、部分Ss-FoxE2基因序列；2、部分潮霉素抗性基因序列；3、Ss-FoxE2上游片段+部分潮霉素抗性基因序列；4、Ss-FoxE2下游片段+部分潮霉素抗性基因序列。综合以上4种验证结果，初步鉴定转化子2-4和5-1为阳性转化子，分别命名为核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体KO.2和KO.5。考虑到研究中快速PCR方法验证具体不稳定性，实验选取了另外一种更为灵41 敏可靠的验证方法：SouthernBlotting。分别采用Ss-FoxE2基因的部分序列片段（probe1）和潮霉素抗性基因的部分序列（probe2）作为杂交实验的探针，对野生型核盘菌基因组DNA和敲除突变体KO.2和KO.5，以及敲除载体质粒对照线性片段进行杂交。以probe1杂交发现，野生型核盘菌基因组DNA能够杂交得到特异条带，而KO.2和KO.5基因组DNA则没有出现任何条带；以probe2杂交发现，KO.2和KO.5基因组DNA能够杂交得到与敲除载体质粒对照相同的特异性条带，而野生型核盘菌基因组的DNA没有出现任何条带。SouthernBlotting结果充分证明：KO.2和KO.5是核盘菌转录因子Ss-FoxE2敲除突变体。通过遗传转化同源重组，我们初步获得了核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体，我们可以通过观察敲除突变体的表型，对照野生型的表型，来分析对比表形的差异，该转录因子在核盘菌生长发育有性生殖等方面的功能。为下一步功能验证提供了实验材料和奠定了实验基础。42 第四章核盘菌转录因子Ss-FoxE2的互补目前，丝状真菌验证其基因功能的手段主要有RNAi基因沉默、基因敲除以及基因的过表达等方法，那么本研究中采取了基因敲除的方法来分析核盘菌转录因子Ss-FoxE2的功能，为了使实验结果更准确、更具说服力，本研究将继续构建Ss-FoxE2的互补载体，通过原生质体融合的方法，将该基因回补到缺失菌株中，然后再观察其表型是否恢复至野生型水平，从而进一步确认基因功能。1材料1.1实验菌株菌株：大肠杆菌E.coliDH5α；核盘菌野生型菌株UF-1，又称1980（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）（已测序菌株）；核盘菌转录因子Ss-FoxE2敲除突变体（KO.2）1.2载体及引物载体：基因快速克隆T载体pMD18-TSampleVector（购于TaKaRa）；丝状真菌互补载体pD-NEO1（本文作者由pD-NAT1改造而成，保存于吉林大学IPM-803实验室）；本实验中所用的引物见表4.1。表4.1引物及序列Tab.4.1Primersequence引物名称引物序列C-F2-FGCTAGCAGTCATGGGGTGGGAGA（NheI）C-F2-RGCGGCCGCtGGAGCTGAAGCACGATA（NotI）NEO-FGGTACCGATATGATTGAACAAGATGNEO-RGTCGACTCCTCAGAAGAACTCGTCF2-ORF-FTTAGTATTGGTTATTGGTGCACAF2-ORF-RATGGATTCCGATCACTTTCAGCAGAA43 1.3主要试剂遗传霉素G418购于长春佳博欣公司，PrimerSTARHSDNApolymerase购自Takara公司，本章所用其他试剂请参考本文第二章、第三章。2方法2.1核盘菌转录因子Ss-FoxE2互补载体的构建2.1.1Ss-FoxE2全序列的克隆根据生物信息学的分析，获取核盘菌转录因子Ss-FoxE2编码基因及其5’-UTR和3’-UTR在内的3.4kb的片段序列，命名为Ss-FoxE2的互补片段（简称C-F2），利用引物设计软件primer5.0，设计特异性PCR引物，引物见表5.1。以核盘菌UF-1基因组DNA为模板，用设计好的Ss-FoxE2互补片段特异性引物C-F2-F/C-F2-R进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：表4.2Ss-FoxE2互补片段PCR扩增体系Tab.4.2PCRamplificationsystemofSs-FoxE2complementfragment成分体积（µl）10×Buffer2.5dNTP1.0模板DNA1.0引物11.0引物21.0TaqDNApolymerase（5U/µl）0.5ddH2O18.0总体积25.0PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30sec，57℃45sec，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃-forever。制备浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，回收产物保存在-20℃环境下备用。44 2.1.2C-F2与pMD18-TVector连接将回收纯化后获得的Ss-FoxE2互补片段C-F2与pMD18-T载体连接，构建重组质粒T-C-F2，具体连接体系如下表所示：表4.3重组质粒连接体系Tab.4.3Ligationsystemofrecombinedplasmid成分体积（µl）回收产物4.5pMD18-T0.5SolutionILigation5.0Mix总体积10.0连接反应条件如下：16℃连接仪中过夜连接。2.1.3重组质粒C-F2的鉴定和提取（1）将重组质粒T-C-F2热击转化进入E.coliDH5α，转化方法参考本文2.1.6。（2）在超净工作台中，挑取筛选平板上的单菌落（若干），接种到800µl筛选抗性（Ampr）的LB液体培养基中（置于1.5mlEP管内），37°C恒温摇床中，200rpm，振荡培养4-5h后的菌液用于菌液PCR的鉴定，PCR扩增体系及条件见表2.1。制备浓度为1%的琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，初步鉴定可以扩增出目的条带的菌液为含阳性重组质粒的菌液。（3）将菌液PCR鉴定为阳性的重组质粒T-C-F2菌液送至博仕生物公司进行DNA测序。（4）提取测序结果正确的重组质粒T-C-F2，质粒提取方法参考本文第二章2.1.8。2.1.4互补载体pD-NEO1-F2的构建及鉴定利用添加限制性内切酶位点NheI和NotI的特异性引物，通过PCR扩增得到一段包括整个Ss-FoxE2基因的开放阅读框和5’-，3’-UTR在内的3.4kb的片段，将该片段克隆到丝状真菌互补载体pD-NEO1中，构建策略：如图5.1所示45 图4.1互补载体pD-NEO1-F2构建策略图示Fig.4.1ComplementvectorpD-NEO1-F2constructionstrategy使用与C-F2扩增引物酶切位点相对应的限制性内切酶NheI和NotI消化经测序确认正确的重组质粒T-C-F2及载体质粒pD-NEO1，酶切体系见表4.4；琼脂糖凝胶电泳检测后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段C-F2，及酶切后线性化载体片段pD-NEO1；将纯化的目的片段C-F2与线性pD-NEO1片段在16℃条件下连接，以构建重组质粒pD-NEO1-F2，连接体系见表4.5；重组质粒pD-NEO1-F2热击转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于含筛选抗性（50μg/ml氨苄霉素抗性和rr50μg/ml卡那霉素抗性，即Amp&Kana双抗性）的LB培养固体基上，37℃环境培rr养16-20小时后；挑取若干单菌落，接种到Amp&Kana筛选抗性的液体LB培养基中，于37℃摇床中震荡培养4-5h，进行菌液PCR验证，该菌液PCR扩增体系参考表1.2，挑取电泳检测为阳性的菌株进行扩大培养，同时吸取适量菌液送至博仕生物公司进行DNA测序，测序确保连接无误后，大量扩增菌液，并使用质粒小提试剂盒大量提取重组质粒pD-NEO1-F2后保存备用。46 表4.4质粒酶切反应体系Tab.4.4Restrictionenzymedigestionsystemofplasmid成分体积（µl）10×buffer5.0酶11.8酶21.8重组质粒15.0ddH2O26.4总体积50.0表4.5重组质粒连接体系Tab.4.5Ligationsystemofrecombinedplasmid成分体积（µl）目的片段3.5线性载体片段1.5SolutionI5.0LigationMix总体积10.02.2敲除菌株原生质体的制备在PDA平板上活化培养核盘菌转录因子Ss-FoxE2敲除突变体（KO.2）两次，用直径为7mm的打孔器菌丝生长边缘打孔，将含生长旺盛菌丝的菌饼正面朝上接种到装有15mlYPSu液体培养基的培养皿中，每皿接3块菌饼，室温培养2-3天；用培养好的KO.2菌丝制备原生质体，原生质体制备方法，请参考本文第三章2.1实验内容。47 2.3PEG-CaCl2法原生质体互补转化将已经提取好的互补载体pD-NEO1-F2的质粒转化到新鲜制备好的敲除菌株KO.2的原生质体中，以完成基因互补的目的，PEG-CaCl2法原生质体互补转化具体方法，请参考本文第三章2.2。2.4互补转化子的抗性筛选在超净工作台中，将平板上陆续长出的核盘菌单菌落编号，并用灭过菌的刀片切取菌丝顶端，接种含遗传霉素G418的PDA培养基（浓度100µg/ml）上进行抗性筛选培养，每次筛选需培养2-3天，总共进行3次筛选，最终获得对G418抗性稳定的转化子菌落。2.5快速PCR法鉴定互补转化子在PDA平板上培养互补转化子的菌丝，然后用打孔器制备含有活力旺盛菌丝的菌饼，用于快速PCR法鉴定互补转化子。快速PCR鉴定的内容包括以下几项内容：2.5.1互补转化子的转录因子Ss-FoxE2部分序列PCR验证选取核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列，大小为712bp，利用primer5.0设计其特异性扩增引物F2-F/F2-R，并用该引物F2-F/F2-R进行快速PCR克隆验证，其原理同第三章敲除突变体的鉴定，请参考本文图3.1。反应体系参考第三章表3.1，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30sec，57℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃-forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。2.5.2遗传霉素G418抗性基因序列PCR验证根据生物信息学的分析，获得遗传霉素G418抗性基因编码区开放阅读框ORF全长为795bp的序列，利用primer5.0软件设计引物neo-F/neo-R，并用该引物进行快速PCR克隆验证，其验证示意如图5.2：图4.2遗传霉素G418抗性基因序列验证示意图Fig.4.2DiagramofverificationofgeneticinG418resistancegenesequence48 反应体系请参考本文表3.1PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30sec，57℃45sec，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃-forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。2.5.3互补序列C-F2的PCR验证以C-F2-F/C-F2-R为PCR引物，特异性扩增互补转化子中的大小为3.4kb的C-F2片段，目的在于比较敲除突变体KO.2中的扩增片段大小，因为以引物C-F2-F/C-F2-R扩异敲除突变体KO.2，则扩增的序列为LB+hyg抗性基因序列+RB，全长约为3.2kb，是小于互补转化子中的该序列的。反应体系请参考本文表4.2，PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30sec，57℃45sec，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃-forever。反应结束后，制备浓度为1.0%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳检测。3结果与分析3.1互补转化子的转录因子Ss-FoxE2部分序列PCR验证结果选取核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列大小为712bp进行克隆，如果该转化子为阳性，那么快速PCR将可以检测到大小为712bp的目的基因片段的存在。PCR检测结果如图4.3所示（注：泳道1-20对应的互补转化子编号依次为：1-C2，2-C3，4-C5，5-C9，6-C11，7-C18，8-C20，9-C25，10-C28，11-C30，12-C31，13-C32，14-C33，15-C34，16-C35，17-C40，18-C42，19-C46，20-C48）：49 图4.3核盘菌转录因子Ss-FoxE2部分序列验证结果Fig.4.3PCRverificationofpartialsequenceofSs-FoxE2Mutant1-20:互补转化子PCR结果；A:敲除突变体KO.2对照；B:野生型对照Mutant1-20:ClonepartialsequenceofSs-FoxE2geneofcomplementtransformants;A:KO.2control；B:Wild-typecontrolM:250bpDNALadderMarker如图所示：泳道1，2，7，8，9，10，12，13，19出现了与野生型对照B泳道同样大小的712bp的条带，其对应的转化子续号依次是1-C2，2-C3，7-C18，8-C20，9-C25，10-C28，12-C31，13-C32，19-C46，则可初步说明这些转化子有可能是阳性转化子。3.2遗传霉素G418抗性基因序列PCR验证结果快速PCR检测遗传霉素G418抗性基因编码区开放阅读框ORF全长为795bp的序列，如果互补载体整个到敲除载体基因组片段中，并且获得了G418抗性，那么在互补转化子中可以检测到长约795bp的序列。PCR检测结果如图4.4所示：（注：泳道1-20对应的互补转化子编号同图4.3）50 图4.4遗传霉素G418抗性基因序列的验证结果Fig.4.4PCRverificationofthegeneticinG418resistancegeneMutant1-20:互补转化子PCR结果；A:敲除突变体KO.2对照；B:野生型对照Mutant1-20:ClonethegeneticinG418resistancegenesequenceofcomplementtransformants;A:KO.2control;B:Wild-typecontrol;M:250bpDNALadderMarker如图所示：泳道1，2，5，7，8，9，10，12，13，14，19，20出现了大小为790bp左右的条带，其对应的转化子续号依次是1-C2，2-C3，5-C9，7-C18，8-C20，9-C25，10-C28，12-C31，13-C32，14-C33，19-C46，20-C48则可初步说明这些转化子有可能是阳性转化子。3.3互补序列C-F2的PCR验证结果：以C-F2-F/C-F2-R为PCR引物，如转化子为阳性，那么互补转化子中将扩增得到的大小为3.4kb的C-F2片段，而敲除突变体KO.2中将扩增得到大小为3.2kb的片段，小于互补转化子中的该序列的。PCR检测结果如图4.5所示（注：泳道1-20对应的互补转化子编号同图4.3）。51 图4.5互补序列C-F2的PCR验证结果Fig.4.5PCRverificationofthecomplementsequenceC-F2Mutant1-20:互补转化子PCR结果；A:敲除突变体KO.2对照；B:野生型对照Mutant1-20:ClonethecomplementsequenceC-F2ofcomplementtransformants;A:KO.2control；B:Wild-typecontrol,M:250bpDNALadderMarker如图所示：泳道A出现的条带大小约为3200bp，泳道B的条带略大于泳道A大小约为3400bp，泳道1，7，8，9，10，19，出现了与野生型对照B泳道同样大小的条带，其对应的转化子续号依次是1-C2，7-C18，8-C20，9-C25，10-C28，19-C46，则可初步说明这些转化子有可能是阳性转化子。综合以上三种检测结果，可以初步认定1-C2，7-C18，8-C20，9-C25，10-C28，19-C46为阳性互补转化子，并完全否定除此之外的其他转化子。3.4互补转化子的Ss-FoxE2编码区ORF序列PCR验证结果将以上三种检测初步筛选出的阳性转化子，再以F2-ORF-F/F2-ORF-R为引物扩增转录因子Ss-FoxE2编码区ORF序列，大小为1409bp，本PCR检测使用的DNA聚合酶为Takara公司的PrimerSTARHSDNApolymerase，该酶的特点是专一且高保真，由于其价格较贵，为减少实验成本，只对已初步筛选为阳性的互补转化子C2，C18，C20，C25，C28，C46进行检测，PCR检测结果如图4.6所示（注：泳道1-6对应的互补转化子编号为：1-C2，2-C18，3-C20，4-C25，5-C28，6-C46）。52 图4.5互补转化子的Ss-FoxE2编码区ORF序列PCR验证结果Fig.4.5PCRverificationoftheSs-FoxE2ORFfragmentsequenceMutant1-6:互补转化子PCR结果；A:敲除突变体KO.2对照；B:野生型对照Mutant1-6:ClonetheSs-FoxE2ORFfragmentsequenceofcomplementtransformants;A:KO.2control；B:Wild-typecontrol如图所示：泳道B出现的条带大小约为1409bp，即Ss-FoxE2编码区ORF序列，泳道3，5，6出现了与野生型对照B泳道同样大小的条带，其对应的转化子续号依次是3-C20，5-C28，6-C46，则综合以上各种结果，确定互补菌株C20，C28，C46为转录因子Ss-FoxE2的阳性互补转化子，将和转录因子Ss-FoxE2缺失菌株KO.2及野生型核盘菌UF-1共同培养，并对比差异，参与基因功能的验证。4小结本章研究中，首先克隆了核盘菌转录因子Ss-FoxE2编码基因及其5’-UTR和3’-UTR在内的共3.4kb的序列片段，将其连接到含G418抗性标记的互补载体pD-NEO1上，成功构建了转录因子Ss-FoxE2的基因互补载体。然后利用Lysing酶处理敲除菌株KO.2的菌丝，制备其原生质体，并使用PEG-CaCl2原生质体转化法，将互补载体质粒转化到KO.2的原生质体细胞中，使其发生同源重组，将基因Ss-FoxE2重新整合到基因组中，达到基因互补的目的。经3次含G418的PDA培养基的筛选培养，初步得到20个互补转化子，然后从4个方面对其进行快速PCR验证，分别是：Ss-FoxE2部分序列的PCR验证；遗传霉素G418抗性基因序列的PCR验证；互补序列C-F2的PCR验证；Ss-FoxE2完整序列的PCR53 验证。多重PCR验证的设计，看似重复，实则可以从多个位置和方向反复验证转化子的真假，避免PCR验证的假阳性。综合分析以上结果，确认第20、28、46号转化子为阳性Ss-FoxE2互补转化子，分别命名为核盘菌转录因子Ss-FoxE2的互补突变体C-20，C-28，C-46。在接下来的实验中，与Ss-FoxE2敲除转化子KO.2共同对比野生型核盘菌，以分析核盘菌转录因子Ss-FoxE2的功能。54 第五章核盘菌转录因子Ss-FoxE2的功能分析本章研究主要通过观察核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除突变体（KO.2）及互补突变体（C46）的生物学及遗传学特征，包括菌丝生长速度，菌丝形态，侵染结构，致病性分析，子囊盘的诱导产生等方面的观察，并对比野生型核盘菌的相应表型，从而对该转录因子的功能进行分析，并着重分析核盘菌转录因子Ss-FoxE2在核盘菌有性生殖中的作用。1材料1.1菌株菌株：核盘菌野生型菌株UF-1（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）；核盘菌转录因子Ss-FoxE2敲除突变体（KO.2）；核盘菌转录因子Ss-FoxE2互补突变体C.46。1.2主要实验仪器光学电子显微镜，本章主要使用其他实验仪器，请参考本文第二章和第三章相应部分内容。2方法2.1菌丝生长速度测定将野生型核盘菌菌株UF-1，核盘菌转录因子Ss-FoxE2敲除突变体（KO.2）和核盘菌转录因子Ss-FoxE2互补突变体C.46分别接种到PDA培养基上进行活化培养两次，用直径为7mm的打孔器在活化好的菌丝生长边缘打孔，将含有生长活力旺盛菌丝的菌饼分别接种到新的PDA培养基中心处，野生型核盘菌、敲除突变体及互补突变体全部设置三次重复培养，置于25℃恒温培养箱中培养。培养每隔12h，利用十字交叉法测量各菌丝生长直径，十字交叉法即以接种菌饼点为圆心，随机测量两个垂直方向菌丝的生长直径，并完整记录，该方法是目前较为准确的测量菌丝生长速度的方法。比较敲除突变体KO.2和互补突变体C46及野生型核盘菌菌丝的生长速度，若生长速度结果存在显著差异，则可推断出转录55 因子基因Ss-FoxE2在核盘菌菌丝的生长发育过程中具有调控作用。2.2菌丝形态及侵染结构的观察采用小琼脂块培养法来培养核盘菌菌株，并制作玻片观察各菌株菌丝的形态及侵染结构，该方法制作的显微玻片可以清晰的呈现出菌丝生长的自然状态，并且十分简捷易操作。小琼脂块培养法具体操作步骤：（1）在超净工作台内，向灭过菌的空平板中放入一根U型玻璃管，再在U型管上面放置一片载玻片，（2）用干净的手术刀切取表面积稍大于盖玻片的PDA培养基小块儿，并用镊子将小琼脂块置于载玻片中央，（3）向平板底部加适量无菌水，注意水不能没过载玻片，加水为避免培养过程中琼脂块的失水干燥；（4）用挑针轻轻刮取事先活化好核盘菌菌丝，并接种到小琼脂块的四侧边缘；（5）接种后，用镊子夹取无菌盖玻片，轻轻覆盖在小琼脂块上表面，然后盖好培养皿，置于25℃恒温培养箱中培养；（6）2-3天培养后，用镊子取下小琼脂块儿上的盖玻片，将覆满菌丝的盖玻片，直接置于显微镜下观察拍照。2.3核盘菌Ss-FoxE2突变体的致病性分析从蕃茄植株上摘取新鲜健康的番茄叶片，将离体的叶片置于覆盖湿润滤纸的大培养皿中，用直径为5mm的打孔器在活化好的菌丝生长边缘打孔，将含有生长活力旺盛菌丝的菌饼，接种到番茄叶片表面，每种菌株设置三次重复，然后将培养皿置于25℃恒温光照培养箱中进行致病培养，培养48h和72h时分别观察并记录蕃茄叶片的发病情况。2.4核盘菌菌核的大量培养核盘菌菌核的大量培养方法具体步骤：（1）将200g去皮土豆均匀切成1.5cm3的小块儿，放入1L带刻度的烧杯中，加入适量水以覆盖住全部土豆块，然后以锡纸封口，121℃高温高压灭菌56 40min后，置于室温冷却过夜；（2）次日，将土豆块轻轻捣碎（不要全部捣成泥，需保留一些明显块状土豆），加水至水位线位于500ml处；称取5g琼脂粉倒入烧杯中与土豆泥混匀，121℃高温高压灭菌40min；（3）灭菌后，稍加冷却，并在培养基没有凝固前，在超净工作台中，将其倒入直径为15cm的培养皿中，尽可能使土豆块在培养基表面形成凹凸状；（4）在培养皿中央接种已活化好的核盘菌菌饼，置于室温培养；（5）培养约三周以后，平板中出现成熟菌核，在超净工作台中，用镊子摘取成熟菌核，置于一个新的干净培养皿中，干燥过夜，次日，保存于4℃环境中备用。2.5核盘菌子囊盘的诱导（1）取适量蛭石铺于培养皿底部，加水浸湿蛭石后，121℃高温高压灭菌20min，冷却后，室温存放备用；（2）成熟菌核表面消毒：向装有成熟菌核的烧杯中，倒入适量安替福民溶液，使菌核完全浸泡其中5min，过滤后，用无菌水漂洗3次，每次5min，最后，用70%的乙醇浸泡洗涤5min，过滤后，置于无菌滤纸上干燥过夜；（3）次日，在超净工作台内，将处理好的成熟菌核放置在蛭石表面；（4）将培养皿置于15°C垂直光照培养箱中恒温培养，24h全垂直光照。定期检查蛭石中的水份，保证湿度。（5）诱导培养4周左右，肉眼能观察到菌核开始萌发出子囊梗，继续培养2周后，可以看到子囊盘的形成；（6）在超净工作台中，分类收集不同生长阶段的子囊盘，置于无菌EP管中，干燥后液氮速冻，置于-80°C冰箱中保存。3结果与分析3.1菌丝生长形态观察及生长速度测定将活化好的野生型核盘菌UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46菌丝制成相同大小的菌饼，并接种到新的PDA平板上，观察和记录其生长状态，培养5天后在PDA平板上的形态，如图5.1所示：57 图5.1野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46在PDA平板上的生长形态观察Fig.5.1Observationofgrowthcharacteristicofwild-type,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-46如上图所示，核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46在PDA平板上的形态，包括菌丝厚度和菌核生长分布，几乎没有发生任何明显变化，说明核盘菌转录因子对核盘菌的生长表型没有影响。核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的菌丝生长速度测定：每个菌株设置三次重复，采用十字交叉法，每生长12h测定一次生长直径，实验记录如下图5.2，并根据测量数据，在Excel软件中绘制生长速率曲线图，如下所示：58 表5.2野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46菌丝生长速度记录及生长曲线图Fig.5.2Determinationofgrowthrateofwild-type,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-46根据数据分析，核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46，三个菌株在菌丝生长速度方面几乎无变化，说明转录因子Ss-FoxE2不参与调控菌丝的生长发育。3.2菌丝形态显微观察采用小琼脂块法培养核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的菌丝，并在光学显微镜观察菌丝形态及侵染结构形态特征，观察结果如下图所示：59 图5.3野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46菌丝形态显微图像Fig.5.3Observationofmyceliummorphologyofwild-type,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-46如上图所示，核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的菌丝均呈现正常的二叉状分枝，分枝角度均为锐角，三种菌丝在其形态上均无明显差异，说明转录因子Ss-FoxE2并不影响菌丝的生长发育。小琼脂块法继续培养至5-7天，在盖玻片上出现菌丝侵染结构，在显微镜下分别观察其侵染垫的结构，并拍照记录，结果如图5.4所示。图5.4野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46侵染结构显微观察结果Fig.5.4Observationofinfectioncushionofwild-type,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46underthemicroscopeUF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-4660 由侵染结构显微观察结果可知，核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的菌丝均能形成正常的侵染结构，且其侵染结构所形成的结构、位置并无明显区别，因此推断出转录因子Ss-FoxE2对核盘菌的侵染结构的发育无影响。3.3菌核数量及干重测量结果在PDA平板上分别培养核盘菌野生型UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的2个菌株，每个菌株设置5次重复，培养至7-10天后，形成成熟菌核，统计每板培养基中成熟菌核的数量，并将其全部摘下烘干后称量其成熟菌核干重，比较三种菌株之间的变化。图5.5为一个PDA平板上摘取的成熟菌核的形态示意图，图5.6为野生型菌株和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46菌核数量及干重对比统计分析图。WTKO.2C-46Sclerotirum/plate图5.5野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46的菌核形态特征Fig.5.5SclerotialmorphologyofthewildtypeSs-FoxE2，knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-4661 AB图5.6野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46的的菌核数量及干重对比统计分析Fig.5.6Comparedtothesclerotialnumberanddryweightbetweenthewildtype,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-46根本对比数据分析，结果发现：Ss-FoxE2敲除突变体KO.2与核盘菌野生型菌株和互补突变体菌株相比，其成熟菌核的表现型及品质，肉眼几乎观察不到任何差异，而Ss-FoxE2敲除突变体KO.2每皿菌核数量及干重虽略小于野生型菌株，但也略大于互补突变体菌株，且差距微小几乎可以忽略不计，因此推断转录因子Ss-FoxE2对核盘菌菌核的发育无明显影响。3.4致病性分析结果分别接种野生型核盘菌UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46的菌饼，至大小及幼嫩程度相同的新鲜番茄叶片上，接种后72小时，观察发病情况并记录。62 图5.7野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46的致病性检测Fig.5.7Pathogenicityanalysisofthewildtype,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46ontomatoleavesUF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-46根本接种番茄叶片的致病性分析实验中可以看出，接种后72小时，肉眼可以观察到，相比于接种了野生型菌株的蕃茄叶片，接种了Ss-FoxE2敲除突变体的蕃茄叶片的病斑面积有微弱的减小，而接种了Ss-FoxE2互补突变体的蕃茄叶片的病斑面积又恢复至野生型水平，较敲除菌株比，病斑面积微微变大，但总体改变程度不显著，且全都可以引起发病，因此致病性差异可以忽略不计。因此，可以推断转录因子Ss-FoxE2对核盘菌的致病性无影响。3.5子囊盘的诱导结果在土豆泥培养基上，分别培养野生型核盘菌UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及互补突变体C-46，大约2周后，收集大量成熟菌核并吹干。在同一个培养皿中，同时放置若干个野生型核盘菌UF-1和Ss-FoxE2敲除突变体的菌核，用纸带隔开并63 正确标记菌株名称，再在另一个培养皿中，上下分别培养Ss-FoxE2敲除突变体和互补突变体C-46的菌核，在同一个培养皿中一起诱导，可以保证诱导过程均发生在同一环境，保证性状的分离不受诱导环境条件的影响，增加结果的说服力。诱导大约5周后，观察培养皿中各菌种子囊盘的萌发情况，并拍照记录，实验结果如图5.8所示。图5.8野生型核盘菌及Ss-FoxE2敲除突变体KO.2，互补突变体C-46菌核的子囊盘诱导情况Fig.5.8Thephenotypeofapotheciaofthewildtype,Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2andSs-FoxE2complementmutantC-46UF-1:野生型核盘菌；KO.2:Ss-FoxE2敲除突变体；C-46:Ss-FoxE2互补突变体UF-1:Wild-type;KO.2:Ss-FoxE2knock-outmutantKO.2;C-46:Ss-FoxE2complementmutantC-4664 根据同皿诱导子囊盘实验，我们发现在相同条件和时间内，Ss-FoxE2敲除突变体KO.2不能诱导萌发产生子囊盘，而野生型核盘菌UF-1则可以产生正常的子囊盘结构，互补突变体C-46也可以产生体积稍小的子囊盘，且适当延长诱导时间后，Ss-FoxE2敲除突变体KO.2依然不能形成子囊盘。根据以上结果，我们得到一个重要结论：核盘菌转录因子Ss-FoxE2的敲除影响了核盘菌子囊盘的正常发育，而Ss-FoxE2的回补又使缺失菌株表型恢复至野生型水平，因此，核盘菌转录因子Ss-FoxE2与子囊盘的发育紧密相关，是一个参与调控核盘菌有性生殖的转录因子。4小结在本章研究中，对已获得的Ss-FoxE2敲除突变体KO.2及其基因互补突变体C-46，对比野生型核盘菌的生物学特性进行转录因子Ss-FoxE2的功能分析，包括其在PDA培养基上的形态、菌丝生长速率、菌丝形态、侵染结构、菌核形态数量及干重、致病性及子囊盘诱导情况。结果表明，转录因子Ss-FoxE2对核盘菌菌丝和菌核阶段的生长状况几乎没有影响，但Ss-FoxE2敲除突变体KO.2的菌核不能萌发形成子囊盘结构，说明转录因子Ss-FoxE2参与调控有性生殖过程中的子囊盘发育。65 结论Forkhead-box类转录因子已被证实在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中存在4个同源基因，且其中两个基因的缺失，能使其突变体在有性发育中发生显著变化。本研究首先在核盘菌基因组中进行序列比对，发现核盘菌基因组中也存在4个Forkhead-box类转录因子的同源基因，其中就包括已研究的Ss-FoxE1，同时，我们推断与稻瘟病菌功能基因同源性最高的核盘菌Forkhead转录因子也可以在核盘菌中调控有性生殖。因此，我们将经比对筛选到的Ss-FoxE1的同源基因命名为Ss-FoxE2，并对其进行主要研究。本研究首先成功构建了Ss-FoxE2的敲除载体，然后利用Lysing酶消化核盘菌菌丝细胞壁，制备了质量较好的原生质体细胞，并用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将已构建好的敲除载体转化到核盘菌的原生质体中，并使用潮霉素抗性培养基来筛选培养转化子，经3次筛选后得到的转化子，使用快速PCR检测方法及Southern杂交对转化子进行验证。验证无误后，再构建Ss-FoxE2的互补载体，将基因回补至敲除突变体中，目的是使其恢复至野生型水平。将Ss-FoxE2敲除突变体和Ss-FoxE2互补突变体对照野生型菌株，进行生物学特性分析和致病性分析，结果发现，转录因子Ss-FoxE2对核盘菌的菌丝、菌核阶段的无性发育以及致病性没有任何影响，但Ss-FoxE2敲除突变体在有性生殖阶段却不能诱导发育形成子囊盘，这说明转录因子Ss-FoxE2影响了核盘菌子囊盘的发育，参与调控核盘菌的有性生殖。关于核盘菌转录因子Ss-FoxE2的基因功能研究的未来工作，将会在转录组和蛋白质组的水平上继续进行，并研究开展其调控转录的下游基因，旨在协助人们更好的防控菌核病，同时也可以为研究其它病原菌提供新思路，更好的促进农业发展。66 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致谢三年的研究生时光，转瞬即逝，回首这看似漫长却又短暂的一千天，感慨思绪千丝万缕。首先感谢我的导师潘洪玉教授对我的教育和包容，他不仅为我提供了精心的指导和优越的实验条件，还经常鼓励我，愿意教导我成长为一个成熟的人，请原谅学生年少不懂事的莽撞，真诚的感谢您对我的宽容和理解。在我硕士生活及论文的完成过程中，还得到了师姐陈景源和师弟刘言志的大力帮助，以及刘金亮老师、张艳华老师的全力支持，同时感谢803实验室全体同学的陪伴和体谅，很荣幸能和大家一起面对学习和生活中的困难与喜悦。还要感谢我的爸爸妈妈和朋友们在我背后默默的支持和鼓励，让我在成长的路上健康而快乐。最后，特别感谢我最优秀的师兄、最耐心的老师、最知心的朋友、最体贴的家人，同是也是漫漫人生路上最好的伴侣--张祥辉先生，执你之手是我人生中最重要的决定，愿与你偕老成为我人生中最浪漫的事儿。73