大麦草酸氧化酶与wrky转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理

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　　大麦草酸氧化酶与WRKY转录因子参与调控核盘菌抗性的分子机理第一章文献综述1病菌的生物学特性1.1菌核病的基本介绍核盘菌是最为普遍和最具毁灭性的植物病原菌之一，对于这种病原菌造成的病症有超过60种描述：棉状腐病（cottonyrot），腐病（rot），冠腐病（croBlight）等。菌核病是一种可以在全球范围对400多种双子叶植物造成毁灭性危害的重要经济病害BolandandHall(1994)，菌核病可以对向日葵、大豆、油菜、菜豆、花生、鹰嘴豆、扁豆以及许多蔬菜作物造成危害，同时也可入侵洋葱、郁金香等单子叶物种。在中国，菌核病居油菜三大病害之首，一般发病率10～30%，严重时可达80%，在长江中、下游及东南沿海主要油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、期南、湖北、江西等地发生尤为突出，严重影响了我国的油菜生产(李方球，官春云,2001)。1.2核盘菌的生物学特性菌核病的病原核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary）属于子囊菌亚门，盘菌纲，柔膜菌目，核盘菌科，核盘菌属。在这个属中主要包括：三叶草核盘菌（S.trifoliorum），细辛核盘菌（S.asari），人参核盘菌（S.ginseng），小核盘菌（S.minor)，核盘菌(S.sclerotiorum)。其中感染油菜的主要是核盘菌（S. sclerotiorum）。核盘菌的生活相对比较简单，一般是通过有性生殖与无性生殖来完成疾病的传播，这种病原菌在土壤中最主要通过菌核存活下来的，在作物收割后或者通过污染的种子被种到土壤中后，菌核通过感染的植物残渣与土壤混合；曾经报道一千克种子中最高含有432颗菌核。据报道，菌核可以可以保持活性、毒性以及致病能力达七年之久(ehta,2008)。Hims（1979）则首先在英国观察到核盘菌以孢子的形式入侵野生植物。.第二章转化大麦草酸氧化酶提高甘蓝型油菜菌核病抗性及其抗性机理初析许多真菌在在入侵植物时会将草酸分泌到植物组织中(Cessnaetal.,2000;Kimetal.,2008b;D18-T以及改造的pBI121s。..1.2大麦草酸氧化酶基因片段的获得及植物转化载体构建用大麦种子在25℃左右发芽，液氮冷冻取大麦种子发芽，用植物高纯度总RNA提取试剂盒提（百泰克）取大麦芽总RNA，方法参见百泰克说明书。cDNA第一链合成使用FermentascDNA第一链合成试剂盒，方法如下：a.取上述提取的总RNA1μg到200μL灭菌离心管中，加入1μLoligodT引物，补充DEPC水到12μL，充分混匀。b.在PCR仪中，有热盖的情况下65℃孵育5min，取出放到冰上进行后面步骤操作。c.分别加入4μL5XReactionBuffer、1μLRiboLockRNA酶抑制剂、2μL10mMdNTPMix、1μLRevertAidM-MuLV。d.PCR仪中加热盖42℃孵育1h。e.70℃加热5min 终止反应。用反转录的cDNA原液稀释10倍作模板，根据已报道的大麦草酸氧化酶（BOXO）（GeneBank登录号Y14203）序列设计引物BF、BR，使用EX-TaqDNA聚合酶（TaKaRa）扩增.3讨论..............863.1BnSA及拟南芥原生质体瞬时表达表明Bnaoetal.,2011;Qiuetal.,2008)，因此推测WRKY28和WRKY40可能是通过调控WRKY33来对病原菌起作用的；Atalexin的基因PAD3和CYP71A13是表现出上调表达的(Pandeyetal.,2010)，说明AtWRKY18和AtWRKY40可能也是通过调控WRKY33起作用的，而当在BnWRKY40过表达植株中检测WRKY33的表达量时（结果中未列出），发现转基因植株相对于对照是上调表达的，并且PAD3和CYP71A13都有上调表达的趋势，因此BnWRKY40单独过表达可能对WRKY33起到一个正调控的作用，这是与之前的报道相吻合的(Xuetal.,2006)。而在BnWRKY28过表达植株，WRKY33却表现出下调表达的趋势（结果中未列出），因此，推测WRKY28对WRKY33的表达起到负调控的作用，AtWRKY28过表达时产生的菌核病抗性可能是通过调节其他路径来实现的，而这里BnWRKY28负调控WRKY33可能是在植物对环境刺激的其他方面起作用，如干旱胁迫，盐胁迫(Babithaetal.,2013;JiangandDeyholos,2009)等。..........