核盘菌转录因子SsAMS2的功能研究

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分类号:S432.1单位代码0183:1研究生学号:2015862020密级:公开_吉林大学硕士学位论文学术学位()核盘菌转录因子SsAMS2的功能研究FunctionalanalysisofthetranscriptionfactorSsAMS2inSclerotiniasclerotiorum作者姓名:王翘楚专业:植物保护研究方向:植物病原真菌分子生物学指导教师:潘洪玉教授培养单位:植物科学学院2018年6月 核盘菌转录因子SsAMS2的功能研究FunctionalanalysisofthetranscriptionfactorSsAMS2inSclerotiniasclerotiorum作者姓名:王翘楚专业名称:植物保护指导教师:潘洪玉教授学位类别:农学硕士答辩日期:2018年5月28日 未经本论文作者的书面授权,依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人,均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用(但纯学术性使用不在此限)。否则,应承担侵权的法律责任。吉林大学博士或硕士学位论文原创性声明()本人郑重声明,:所呈交学位论文,是本人在指号教师的指导下独立进行研宄工作所取得的成果,。除文中已经注明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果=对本文的研宂做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式!:标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名:曰期山丨?年(!月今曰 中文摘要核盘菌转录因子SsAMS2的功能研究核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)是一种死体营养型植物病原真菌,可以侵染400多种植物,在世界范围内造成巨大的经济损失。侵染垫是核盘菌重要的侵染结构,在侵入寄主组织中起决定性作用,在与寄主互作过程中,核盘菌能够产生一系列的致病因子,草酸在破坏细胞结构,降低寄主抗性方面具有重要作用,是核盘菌的重要致病因子。在核盘菌中存在9个含有GATA锌指结构域的转录因子。其中,SsNsd1已有研究能够调控菌核、子囊盘、侵染垫的形成与发育,并对核盘菌精孢子的产生有负调控作用。SsAMS2也是一个GATA转录因子,与裂殖酵母中的Ams2具有同源性,推断其在调控组蛋白基因转录起始中起重要作用。本研究克隆得到SsAms2基因的两个靶序列,并连接于RNAi载体pSilent-Dual上,将重组质粒转入核盘菌原生质体后对基因SsAms2进行沉默,得到沉默转化子,发现沉默转化子中SsAms2基因的表达量显著下降。进一步分析沉默转化子与野生型的表型差异,在核盘菌的生长发育方面,沉默转化子的菌丝生长速率变慢,菌核形成总重量降低,菌丝弯曲,分枝显直角,且分枝菌丝生长短小。同时发现沉默转化子的菌丝中细胞核数量减少。通过对组蛋白(H2A,H2B,H3,H4)及组蛋白H3变异体CENP-A编码基因的表达量分析,组蛋白基因均出现下调。对细胞周期调控蛋白Cdc6,Cdc28进行表达量分析,其表达量也出现下调。研究结果暗示SsAMS2能够调控S期组蛋白基因的转录,影响细胞的分裂过程,从而调控核盘菌的生长过程。SsAms2被沉默后,在含过氧化氢平板上生长的核盘菌相对于野生型并未受到抑制,反而有抗性增强的趋势,推测SsAms2对过氧化物酶的产生有负调控作用。在抗高盐渗透胁迫环境下,野生型及沉默转化子的抑制效果无显著差异,证明SsAms2不参与调控高渗透抗性。此外,沉默转化子的侵染垫形成显著减少,草酸的产生量也明显减少。通过离体菜豆叶片接种实验,离体叶片的发病速度显著降低,进一步阐明SsAms2在核盘菌致病性方面具有重要调控作用。I 上述有关核盘菌转录因子基因SsAms2的功能研究,进一步加深了对核盘菌生长发育与致病机制的解析问题探索与解析,为菌核病的防治提供新理论与新思路。关键词:核盘菌,转录因子,SsAms2,生长发育,致病性II AbstractFunctionalanalysisofthetranscriptionfactorSsAMS2inSclerotiniasclerotiorumSclerotiniasclerotiorumisanecrotrophicplantpathogencausingsignificantfinancialloss.Over400plantspeciescanbeinfectedbyS.sclerotiorum.Infectioncushionistheimportantinfectionstructurewhichplaysadecisiveroleincausinghostsdiseaseoutbreak.IntheinteractionbetweenS.sclerotiorumandhosts,S.sclerotiorumproducearangeofpathogenicfactors.Oxalicacidisoneoftheimportantpathogenicfactors,andplayscriticalrolesinpathogenicity,virulenceandcompetitionwithotherfungalspecies.EighttranscriptionfactorcontainingGATAzincfingerdomainswerepredictedinS.sclerotiorum.Amongthese,SsNsd1hasbeendemonstratedtobeinvolvedinsclerotia,apotheciaandinfectcushiondevelopment,andnegativelycontrolspermosporeformation.SsAMS2isaGATAtranscriptionfactor,whichishomologouswithAms2inSchizosaccharomycespombe.SowepredictSsAMS2isinvolvedintranscriptioninitation.Inthisstudy,twotargetsequencesofSsAms2wasclonedandligatedintopSilent-Dual1.Thereconstructionplasmidsweretransformed2+intoprotoplastsofwildtypemediatedbypolyethyleneglycol(PEG)-CaandSsAms2wassilenced.Thusthetransformantswereobtained.TheexpressionlevelsofSsAms2intransformantsweresignificantlydownregulated.TheRNAimutantsexhibiteddefectinhyphalgrowthanddevelopment,decreasedsclerotiaweight,curvedhyphae.Andthenumbersofcellnucleiweredecreasd.Therelativelytranscriptionlevelofhistonesandhistonevariantgenesweredownregulated,besides,thecellcyclerelativefactorCdc6,Cdc28genetranscriptionlevelwerealsodownregulated.TheseresultssuggestthatSsAMS2regulatedhistonegenesIII transcriptionandcelldivision.TheresistancetooxidativestresswereenhancedwhenSsAms2wassilenced,theresultssuggestthatSsAms2negativelycontrolperoxidaseproduction.Therewasnosignificantdifferenceinresistancetoosmoticstressbetweentransformantsandwildtype.Thetransformantsproducedecreasedinfectcushionandoxalicacid,andwheninoculatedtomarrowbeanleavestheincidenceratewerereduced.TheresultsindicatedthatSsAms2playsimportantrolesinpathogenicity.ThegenefunctionanalysisprovidetheorybasisforS.sclerotiorumcontrol.KeyWords:Sclerotiniasclerotiorum,transcriptionfactor,SsAms2,growthanddevelopment,pathologicityIV 目录第一章绪论....................................................................................................................11核盘菌.......................................................................................................................11.1核盘菌分类地位...............................................................................................11.2核盘菌生长发育...............................................................................................11.3核盘菌致病关键因子.......................................................................................31.4菌核病发生与防控研究...................................................................................52GATA转录因子研究进展.....................................................................................62.1GATA转录因子简介.......................................................................................62.2GATA转录因子的生物学功能......................................................................72.3GATA转录因子Ams2研究进展..................................................................73组蛋白及其相关研究..............................................................................................84基因功能研究技术..................................................................................................94.1RNA干扰技术..................................................................................................94.2基因敲除技术.................................................................................................104.3CRISPR/Cas9技术.........................................................................................104.4T-DNA插入....................................................................................................115本研究的目的和意义............................................................................................11第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化..............................................131实验材料.................................................................................................................131.1菌株、载体及引物.........................................................................................131.2主要仪器..........................................................................................................131.3主要试剂..........................................................................................................131.4培养基及试剂配制.........................................................................................142实验方法.................................................................................................................152.1SsAms2基因克隆............................................................................................152.2SsAms2RNAi载体构建.................................................................................17I 2.3核盘菌遗传转化及SsAms2沉默转化子的筛选.........................................212.4SsAms2沉默转化子的验证...........................................................................233结果与分析............................................................................................................243.1SsAms2生物信息学分析...............................................................................243.2PCR验证沉默转化子....................................................................................264小结.........................................................................................................................28第三章转录因子SsAMS2的功能验证....................................................................291实验材料.................................................................................................................291.1菌株、载体及引物.........................................................................................291.2主要仪器..........................................................................................................291.3主要试剂..........................................................................................................291.4培养基及试剂配制.........................................................................................292实验方法.................................................................................................................302.1沉默转化子菌落形态观察............................................................................302.2沉默转化子生长速率测定............................................................................302.3沉默转化子菌丝形态及分枝观察................................................................302.4沉默转化子侵染垫形成观察........................................................................302.5沉默转化子草酸分泌测定............................................................................312.6沉默转化子的致病力测定............................................................................312.7沉默转化子抗活性氧及高盐测定................................................................322.8沉默转化子菌丝细胞核测定........................................................................322.9组蛋白基因及细胞分裂相关基因表达量分析...........................................333结果与分析............................................................................................................343.1沉默转化子菌落形态.....................................................................................343.2沉默转化子菌核形成.....................................................................................343.3菌丝生长速率测定.........................................................................................363.4沉默转化子菌丝形态及分枝观察................................................................363.5沉默转化子的侵染垫形成观察....................................................................37II 3.6沉默转化子的草酸产生.................................................................................383.7沉默转化子致病力测定.................................................................................403.8沉默转化子抗活性氧及高盐测定................................................................413.9沉默转化子细胞核数量测定........................................................................423.10沉默转化子组蛋白基因及细胞分裂相关基因表达量分析....................454小结.........................................................................................................................47结论...........................................................................................................................49参考文献...........................................................................................................................51致谢...........................................................................................................................65III 第一章绪论第一章绪论1核盘菌1.1核盘菌分类地位核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、柔膜菌目(Helotiales)、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、核盘菌属(Sclerotinia)。其分类主要是根据菌核组织的[1,2][3-5][6]超微结构特点与发育情况、子囊盘特点、生物化学特征以及rRNA基因[7,8]序列。核盘菌最显著的特征是菌丝沉积黑色素并聚集形成菌核。核盘菌是一种世界性的死体营养型植物病原真菌,能够在世界范围内侵染超过400种的植物,其中包括许多重要的经济作物。核盘菌能够侵染许多双子叶植物,包括向日葵、大豆、油菜、鹰嘴豆、花生、豌豆以及许多蔬菜,除此之外也能侵染洋[9]葱、郁金香等单子叶植物,在全世界范围内每年造成巨大的经济损失。由于核盘菌寄生范围广,在逆境环境下生命力顽强,能够长期存活,同时寄主缺少对核盘菌的抗性,防治难度较大,造成作物产量的巨大损失,引起了世界范围[10,11]学者的广泛关注。1.2核盘菌生长发育核盘菌具有完整的生活史,能够适应不同的生长环境(图1.1)。核盘菌不产生分生孢子,但是能够通过其菌丝的聚集和黑色素的沉积形成黑色坚硬的菌[12]核。菌核是核盘菌生活史中一种重要的无性结构,质地坚硬,能够在干旱、低温、酸碱性等非生物极端环境下保持生命力,同时还能抵抗生物刺激,最多[13]能够存活八年之久,由于这些特点菌核成为菌核病防治的难点所在。菌核是受核盘菌侵染后植物最显著的特征,通常形成于受侵染植物的茎或其他组织内[10]部,在高湿度的环境下菌核也会形成于组织的表面。已有报道核盘菌Forkhead-box类转录因子SsFKH1能够参与黑色素的形成,并且调控菌核的形[14]成,SsFkh1基因被沉默后,沉默突变体不能通过菌丝的聚集产生菌核。GATA1 第一章绪论类转录因子SsNsd1也参与调控菌核的形成,SsNsd1基因被敲除后,核盘菌产[15]生菌核的体积变小,菌核干重总重量降低。菌核在适宜的温度、湿度和光照条件下能够重新萌发形成菌丝,在适宜湿度,16℃,光照条件下菌核萌发产生子囊盘,每个菌核上可以产生多个子囊盘,子囊盘呈圆盘状,浅褐色,是核盘菌的有性生殖结构。Forkhead-box类转录因子Ss-FoxE2与GATA类转录因子SsNsd1均能够调控核盘菌的有性生殖中的子囊盘发育,Ss-FoxE2和SsNsd1分[15,16]别被敲除后,其突变体均不能产生子囊盘。成熟的子囊盘会释放子囊孢子,子囊孢子随空气传播侵染植物,一般先侵染植物的坏死或衰老部位,再向健康[17-21]的组织扩散,侵入到植物中的核盘菌能够继续产生菌核和子囊孢子。核盘[10]菌不产生分生孢子但能够产生一种小分生孢子或称精孢子,在精孢子的形成过程中,GATA类转录因子SsNsd1具有负调控作用,SsNsd1被敲除后,敲除[15]突变体的菌丝上能够产生大量的精孢子,但关于小分生孢子在生长发育以及侵染寄主过程中的作用还未见报道。图1.1核盘菌生活史示意图(JeffreyA.Rollins)Fig.1.1LifecycleofSclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary2 第一章绪论1.3核盘菌致病关键因子1.3.1细胞壁降解酶(cellwalldegradingenzymes,CWDEs)植物病原真菌能够产生一系列CWDEs,包括果胶酶、β-1,3-葡聚糖酶、糖[22]苷酶、纤维素水解酶、木聚糖酶、角质酶,这些酶在植物病原真菌对寄主的侵染过程起到促进作用。在与寄主的互作中,核盘菌能够分泌CWDEs协助其[23-25]穿透,软化寄主组织、降解植物细胞壁。SsXyl1是β-1,4-木聚糖酶的编码基因,在核盘菌侵染寄主过程中,其表达量显著上调,SsXyl1被敲除后,突变[26]体失去致病性。果胶酶是一种重要的CWDEs,能够降解植物细胞壁,促进核盘菌侵入和定殖于寄主中,同时还为核盘菌的生长提供了营养。核盘菌能够产生多种形式的果胶分解酶,使核盘菌具有足够的能力杀死植物细胞,侵入植[27]物组织。核盘菌中的果胶酶活性是由果胶或果胶单体诱导激活,例如半乳糖[28,29]醛酸,但是在单糖存在时活性受到抑制。聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases,PGs)是一种重要的果胶酶,可以分为胞内聚半乳糖醛酸酶(endoPGs)和胞外聚半乳糖醛酸酶(exoPGs),endoPGs能够催化细胞内的聚半乳糖醛酸的水解,exoPGs将含果胶的细胞壁多糖水解为单糖或二糖,从而[30]导致细胞破碎并释放营养物质。植物能够产生聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白[31](polygalacturonase-inhibitingproteins,PGIPs)抑制真菌endoPGs的活性,例[32,33]如大豆中的PGIPs能够抑制核盘菌中的endoPGs活性。通过endoPGs酶解植物细胞壁产生的寡聚半乳糖醛酸被证明是过敏性坏死反应(hypersensitive[34]response,HR)的內源激发子,而菜豆的PGIPs可以拮抗核盘菌endoPGs诱[35]导产生的HR反应。将深绿木霉菌(Trichodermaatroviride)中的几丁质酶编码基因chit42和菜豆(Phaseolusvulgaris)中的聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白编码基因pgip2转入油菜中,使其在油菜中稳定表达产生几丁质酶和PGIPs,得到的[36]转基因油菜对核盘菌的抗病性显著增强。核盘菌中的非果胶酶类的CWDEs[24,受到较少关注,其中蛋白酶、纤维素水解酶、葡萄糖淀粉酶已经有研究报道25,31,37],除果胶外,纤维素同样是植物细胞壁的重要组成成分,并且在植物细[38]胞壁还有多达10%的蛋白质,因此纤维素水解酶和蛋白酶也在核盘菌的致病过程中起重要作用。3 第一章绪论1.3.2草酸草酸是植物病原真菌分泌的一种次级代谢产物。在核盘菌中,草酸是一种重要的致病因子,在致病性、与其他真菌竞争和控制环境中的营养或毒素中起[39]重要作用。核盘菌中的草酸乙酰水解酶(oxaloacetateacetylhydrolase,OAH)编码基因Ss-oah1被敲除后,其草酸产生量显著减少,敲除突变体的致病性显[40]著降低。草酸的致病机制主要有以下方面:第一,核盘菌分泌的草酸降低了环境中的pH值,酸性环境对植物细胞有直接的毒害作用,会引起细胞通透性[41]改变,线粒体和叶绿体结构被破坏,同时由于CWDEs的最适pH值小于5,[42-45]低pH值环境下CWDEs的活性提高,加速了CWDEs对寄主细胞壁的降解,从而导致细胞死亡,为死体营养型病原真菌提供了充足的营养。第二,分泌的2+2+草酸会螯合Ca,PGs不能单独水解螯合了Ca的果胶质,需要与草酸协同作2+用。草酸先螯合细胞壁中的Ca,PGs才能对果胶进行降解,从而破坏植物细[42,46]2+[42]胞壁完整性,此外植物中依赖Ca的防卫反应也会被减弱。第三,草酸能够抑制活性氧迸发,而活性氧迸发是植物的一种重要的早期防卫反应,因而[47]草酸通过抑制活性氧迸发降低了寄主的抗病反应。第四,草酸可以诱导植物叶片的气孔打开,抑制脱落酸诱导的气孔关闭,从而减弱植物防卫细胞的功能,[48][43,44]引起植物叶片的萎蔫。第五,草酸会抑制植物产生的多酚氧化酶活性。第六,一些对pH值敏感并与致病性相关的基因会因pH值的降低表达量上升,[49]从而提高核盘菌的致病性,转录因子PAC1是核盘菌中的一个毒性因子,研[50,51]究表明在环境中pH值升高时其转录水平会升高。Smk1在菌核发育相关的MAPK信号通路中起重要作用,当草酸积累导致环境pH呈酸性时表达量会大[52]幅度上升。因此,环境中低的pH值会让植物中的相关基因表达量发生变化,降低寄主植物的抗病反应,使其对病原菌更加敏感。1.3.3效应因子植物对病原菌的免疫反应包括先天免疫反应和后天免疫反应,先天免疫反应中包括病原物/损伤性相关分子模式(pathogen/damage-associatedpatterns,PAMPs)激发的免疫反应(PAMP-triggeredimmunity,PTI),病原菌为了抑制PTI进化出效应蛋白,而效应蛋白又能被植物识别,并触发效应因子激发的免疫反4 第一章绪论[53]应(effector-triggeredimmunity,ETI),在ETI中常常会产生HR反应,通过侵染点周围组织的坏死抑制病原菌在植物中的扩展,但这种免疫仅对活体型病原菌有效,而对死体营养型植物病原菌的侵染无效。真菌效应蛋白可在真菌菌丝与宿主之间的相互作用区域直接转移至植物体内而起作用。这些效应蛋白能抑制植物防御反应,调控植物生理机制使其能适应真菌侵染,并为真菌提供营养物质。大部分效应蛋白是具有催化活性的酶类,通过对植物中的蛋白进行修饰改变植物的生理状态,效应蛋白还可以通过调节植物激素来改变植物的生理状态,降低寄主抗性,还有些效应蛋白可以模拟植物细胞膜表面的受体蛋白,并竞争性结合病原菌的PAMPs/DAMPs,从而干扰植物的PTI。此外,一些效应因子还具有像转录因子一样的转录活性。死体营养型的植物病原菌中也可以分泌效应因子,在核盘菌中,SsSSVP1的N末端含有一段信号肽(signalpeptide,SP),能够在细胞间转移,进入植物细胞中,是核盘菌的一个效应蛋白,在核ΔSP盘菌的致病过程中起重要作用,将SsSSVP1转入本生烟(Nicotianabenthamiana)中能够诱导植物细胞坏死。QCR8是植物细胞色素b-c1复合体的ΔSP一个亚基,SsSSVP1能够与QCR8相互作用,使QCR8不能正常定位于线粒体,扰乱其生物学功能,因此效应因子SsSSVP1能够扰乱植物的能量代谢,降[54]低寄主抗性,从而促进核盘菌对植物的侵染和定殖。1.4菌核病发生与防控研究核盘菌是一种死体营养型植物病原真菌,寄主范围广泛。植物受核盘菌侵染后的病害症状较多,叶部受侵染后通常产生水渍状病斑,病斑会迅速扩展并侵染至茎部,植物的茎部受到核盘菌侵染后会形成黑色的病斑或水渍状病斑。病斑通常会发展成为坏死组织,在坏死组织之中会形成绒毛状白色菌丝,发病部位产生白色菌丝是受核盘菌侵染中后期产生的最明显的症状。当核盘菌侵染至主茎时,会出现萎蔫的症状,随着病斑的扩大,受侵染部位会变白并碎裂,仅剩下维管组织。当湿度足够时会形成菌核,菌核通常产生于花部和种子产生部位,当向日葵受到侵染时,花托中能够产生大量的菌核。一旦核盘菌侵入寄[10]主,菌核病会传染至其相邻植物。由于核盘菌寄主范围广,寄主缺少足够抗性,对于核盘菌的防治一直是农5 第一章绪论业生产上的一个难题。目前防治菌核病仍依赖于化学农药防治,农业上常用的杀菌剂主要有多菌灵、腐霉利、百菌清等,但由于杀菌剂的长期单一使用,核盘菌产生抗药性,此外,化学杀菌剂还会产生污染坏境,农药残留,影响生态[55]等问题。除化学防治外,农业防治也用来防治菌核病,包括轮作、间作、套作、水分调节、合理施肥等方法,但农业防治的防治效果具有局限性,且费时费力,防治效果不明显。通过对抗病育种的研究,植物对核盘菌的抗性与数量[56]性状基因座(Quantitativetraitlocus,QTLs)有关,已有报道在作物中鉴定[57-59]出与抗病性相关的QTLs,利用转基因育种的方法能够获得抗性品种,同时在核盘菌中已经研究发现与致病性相关的基因,将为菌核病的防控提供新的思路。在生物防治方面,已有研究发现一些生防菌对核盘菌具有一定的防治效果,比如小盾壳霉(Coniothyriumminitans)、细顶棍孢霉(Sporidesmium[60-64]sclerotivorum)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)等,这些生防菌可以分泌抗菌素(AFS)抑制菌丝和菌核生长,目前已有商品化的盾壳霉生防制剂用于实际生产。关于生防菌盾壳霉对核盘菌的防控机制已有了一些研究,盾壳霉具有两种与抗真菌相关的基因camg1和CH1,分别编码产生β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶,这两种酶在盾壳霉侵染核盘菌的过程中具有重要作用,能够降解[65,66]核盘菌的细胞壁,从而抑制核盘菌的生长。2GATA转录因子研究进展2.1GATA转录因子简介[67]GATA锌指结构转录因子在鸡的珠蛋白基因启动子之中首次被发现。随后又发现了GATA-1到GATA-6等多个GATA转录因子,在珠蛋白基因和其他红系特异性表达基因的调节顺序和编码顺序中发现有多组共同序列[AT]GATA[AG],并且与该基序特异结合的因子被鉴定,将其命名为GATA转录因子。GATA型锌指转录因子广泛存在于真核生物中,其C端普遍具有IV[68]型锌指结构(CX2CX17-20CX2C),GATA锌指结构域的二级结构包含一个α结构和4个β折叠。GATA转录因子能够特异性结合到启动子的[AT]GATA[AG]6 第一章绪论序列上。截止2018年1月,在NCBI中已有16704条GATA基因登记。2.2GATA转录因子的生物学功能GATA锌指结构转录因子在调控生理代谢和多细胞发育方面起着重要作用,在真菌中有许多GATA转录因子被鉴定,并取得了不少成果。在真菌中发现了许多GATA转录因子与氮的代谢相关,比如粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)[69,70][71,72]中的NIT2、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)中的AREA、白色念珠[73]菌(Candidaalbicans)中的GLN3和GAT1、轮枝镰刀菌(Fusarium[74]verticillioides)中的AREA、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)中的[75]Gat1。一些GATA转录因子能调控菌丝生长,与致病力相关,马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)中的AreA、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)中的Nit2、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)中的FNR1、白色念珠菌(C.albicans)中的GAT1和豆刺盘孢菌(Colletotrichumlindemuthianum)中的CLNR1不仅可以[76-80]调控氮代谢,还与致病性相关,白色念珠菌(C.albicans)中的BRG1、[81,82]NRG1和Gat2能够调控菌丝的生长和致病性。一些GATA转录因子可以响应铁离子信号从而合成铁素,比如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete[83]chrysosporium)中的PIR1、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)中的[84][85]SRE1、构巢曲霉(A.nidulans)中的SREA。GATA转录因子在调控真菌的生长发育过程中发挥重要作用,构巢曲霉(A.nidulans)中的AreB和新型隐球菌(C.neoformans)中的Cir1能够调控交配型,粗糙脉孢菌(N.crassa)中的Wc-1和Wc-2可以相互作用作为一个转录因子复合体蓝光受体WCC,调控[86-89]生物节律,此外还有一些转录因子在有性或无性发育方面都具有调控作用[90,91]。在核盘菌中,共有9个含有GATA锌指结构域的转录因子,其中SsNsd1[15]能够调控菌核,子囊盘,侵染垫的形成,对核盘菌精孢子的产生有负调控作用。2.3GATA转录因子Ams2研究进展[92]在真核生物细胞中,组蛋白基因的表达受细胞周期依赖行为的调控,在裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中,Ams2是一个含有GATA锌指结构域的转录因子,能够特异性结合到组蛋白基因的启动子区域,聚集于着丝点并7 第一章绪论[93]转录激活细胞分裂S期核心组蛋白基因的转录与表达。Ams2能够调控组蛋[94]白H3变异体SpCENP-A定位于着丝点,在调控染色体分离中起重要作用。Ams2的缺失或过量的Ams2表达都会影响组蛋白的正常合成,在G2期Ams2的过表达同样会导致组蛋白不能正常聚集于着丝点并导致基因组的不稳定,在G1期Ams2的过表达会影响正常的减数分裂过程,因而细胞周期相关的正常Ams2表达水平对维持着丝粒的完整和基因组的稳定性至关重要,并且在有丝[92,95]分裂和减数分裂中Ams2均起到重要的调控作用。Ams2在组蛋白合成的S期表达量最高,在S期后期Ams2被降解,避免在G2期,M期和G1期过量的Pof3组蛋白表达,在G2期和M期,泛素E3连接酶SCF(Skp1-Cullin-F-box),可以结合Ams2,使其泛素化,同时Hsk1-Dfp1激酶使Ams2氧化磷酸化并降[92,95]解,在G1期Ams2的及时降解也是保证DNA正常复制的必要条件,特别Cdh1是在减数分裂过程中,在G1期细胞中Ams2被泛素E3连接酶APC/C[92](anaphase-promotingcomplex/cyclosome)泛素化并降解。3组蛋白及其相关研究[96]在真核生物细胞中,染色质中的DNA装配于核小体中,核小体是染色质的基本组成单位,由组蛋白八聚体和145-147bp的DNA组成,组蛋白八聚体[97]由各两组分的H2A,H2B,H3,H4的组成,此外还存在一些组蛋白变异体。[98]组蛋白是染色体的基本组成成分,在转录起始中起重要调控作用。组蛋白的共价修饰,包括组蛋白末端的甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等,可以改变核小体的结构,从而影响转录因子与基因启动子DNA结合域的亲和性,进而[99-102]激活或抑制转录,真核生物的组蛋白在进化上十分保守,尤其是组蛋白[103,104]H3和H4。细胞中组蛋白的含量随着细胞周期循环而变化,在细胞分裂[105]的S期,大量的组蛋白合成,这个过程由大量的组蛋白基因调控,而核心组蛋白的异位表达会对染色体传递的保真性有负面影响,适当的组蛋白基因表达[92]水平对于染色体分离和基因组稳定性具有重要作用。一些转录因子能够结合[93]到组蛋白的启动子区并启动组蛋白基因的转录,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,Spt10p和Spt21p蛋白能够与组蛋白基因相互作用共同激活组蛋8 第一章绪论[106,107]白基因的表达,Spt21p蛋白在细胞分裂S期积累并在Spt10p依赖条件下结合到组蛋白基因启动子上,Spt10p包含一个C2H2锌指结构域,能够结合组[108]蛋白启动子的上游激活序列。在裂殖酵母中,Ams2能够通过GATA锌指结构域结合到组蛋白启动子序列DNA上,其N末端区域自身相互作用,在Ams2结合组蛋白启动子区域前,首先需要Teb1蛋白结合到组蛋白基因启动子区域的AACCCT-box的TTAGGG序列中,作为Ams2结合前的标记,同时Ams2与[93]Teb1的N末端也存在相互作用。4基因功能研究技术4.1RNA干扰技术RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由21-23bp的双链小片段RNA诱发的同源mRNA特异性降解,从而降低基因的表达量,RNAi现象广泛存在于[109,110]真核生物中。RNAi几乎能够发生于所有真核生物细胞中,在研究秀丽新[111,112]小杆线虫(Caenorhabditiselegans)中首次被发现,并被命名为RNAi。在真菌中,有相关报道证明RNAi能够发生于米曲霉(Aspergillusoryzae),粗[113,114]糙脉孢菌(N.crassa)和裂殖酵母中(S.pombe)中。在应用RNAi技术进行基因功能验证中,通过构建沉默质粒载体来实现对目的基因的沉默,将连接目的基因片段的重组载体转入宿主细胞中能够形成双链RNA,双链RNA被核酸内切酶Dicer切割成21-23bp的小片段RNA,即siRNA。通过原生质体转化方法可以将目的基因的siRNA表达盒整合至转化细胞的基因组中,从而实现siRNA的持久转录。siRNA被细胞中的RNA解旋酶解旋,产生正义链和反义链,反义链与细胞中的解旋酶、内切酶、外切酶等结合成为RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),对同源mRNA进行切割。当一些基因被敲除后会致死,或目的基因在生物体中有多个拷贝数时,RNAi是最[115-117]合适的基因功能研究方法。但是在一些真菌中由于缺乏RNAi的某些组分不能使用该技术进行基因功能研究,比如玉米黑粉菌(U.maydis)、白色念[118]珠菌(C.albicans)和酿酒酵母(S.cerevisiae)。9 第一章绪论4.2基因敲除技术利用同源重组原理,将目的基因的上下游同源片段连接在抗性标记基因两2+端,通过PEG-Ga或农杆菌介导的方法将重组载体或重组片段转入生物细胞后,同源片段之间发生同源重组,从而将目的基因替换为抗性基因,实现基因敲除,再利用抗性标记对敲除转化子进行筛选。基因敲除技术能够将目的基因完全敲除,可以对基因功能进行明确研究,在实际应用中有一定的优势,但在不同的生物体中发生同源重组的几率不同,在实际应用中转化效率也受到一些因素的[119,120]影响,因而在不同生物细胞中应用基因敲除实验的效率也有差别。4.3CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas系统是原核生物的一种免疫系统,能够让细菌抵抗噬菌体或外源质粒的入侵,当细菌遭受外源遗传物质的入侵时会产生“记忆”,抵抗他们的再次入侵。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)是指成簇的规律间隔短回文重复序列,广泛存在于细菌和古细菌中。CRISPR序列包括重复序列区(repeat)和间隔区(spacer),重复序列区可以形成发卡结构,间隔区是侵入细菌的外源DNA序列。在CRISPR上游存在前导区,前导区是CRISPR序列的启动子。在上游还存在一个CRISPR关联基因(CRISPRassociated,Cas),目前已发现了多种类型的Cas基因,包括Cas1-Cas10,其中CRISPR/Cas9系统研究最为深入,并已得到广泛应用。当病毒或外源DNA侵入后,其DNA的一段序列会被整合至CRISPR序列中的间隔区,这段序列被称为原间隔序列(protospacer),原间隔序列两端均有保守的NGG三个碱基,这三个碱基被称为间隔序列临近基序(protospaceradjacentmotif,PAM)。当外源DNA入侵时,Cas蛋白识别出PAM序列,并将PAM序列附近的原间隔序列从DNA序列中剪切下来,插入CRISPR序列之中从而添加了一段新的间隔序列。当外源DNA再次入侵时,CRISPR序列会在前导区的调控下转录形成pre-CRISPR-derivedRNA(pre-crRNA)和trans-actingcrRNA(tracrRNA),pre-crRNA由整段CRISPR序列转录形成,tracrRNA具有发卡结构,由重复序列区转录形成,Cas9基因能够编码得到具有切割双链DNA10 第一章绪论功能的Cas9蛋白,在RNaseⅢ的协助下选取对应的间隔序列RNA将pre-crRNA剪切成为crRNA。Cas9蛋白,crRNA和tracrRNA组装成为复合物,DNA双链被解开后,crRNA特异性结合互补序列,Cas9蛋白对两条DNA单链进行剪切,从而使DNA双链断裂,破坏入侵DNA。在实际应用中,在基因的上下游的PAM结构附近各设计一条向导RNA(guideRNA,gRNA),连接至含有Cas9蛋白编码基因的质粒中,转入细胞后,gRNA会靶向定位于互补序列附近,Cas9蛋白对序列进行剪切,从而实现基因的敲除。CRISPR/Cas9技术已被广泛应用于动[121-123]物与植物的基因编辑中,但在真菌中应用较少。4.4T-DNA插入T-DNA(TransferDNA)是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Ti质粒(Tumorinducingplasmid)上的一个片段,又叫三螺旋DNA。农杆菌可以侵染几乎所有双子叶植物并形成根瘤,通过根癌农杆菌侵染,T-DNA可以随机插入宿主基因组DNA中,使基因组中的一些基因的功能缺失。T-DNA技术已成为[124,反向遗传学的重要研究技术,在丝状真菌的基因功能探究中已有广泛应用125]。5本研究的目的和意义核盘菌寄主广泛,每年都造成巨大的经济损失,对核盘菌的防治难度较大,而目前应用的化学防治不仅影响生态,破坏环境,还会使核盘菌产生抗药性,因而需要研究更为有效的防治方法。目前可以通过分子生物学的方法探究核盘菌生长发育以及致病机制,寻求防治核盘菌的更为有效且环保的防治方法,为农作物防治提供新思路。GATA锌指结构转录因子广泛存在于动物、植物以及真菌中,在植物中能够响应光信号、调控叶绿素合成、响应细胞分裂素以及调控元素代谢,在真菌中也有了不少的研究,在响应光信号,提控生物节律、调控生理代谢和多细胞发育方面起着重要作用。在核盘菌中,SsAMS2是一个GATA类的转录因子,与裂殖酵母中的Ams2具有同源性,因此推测基因SsAms2也能够调控细胞分裂11 第一章绪论中组蛋白的行为从而调控核盘菌的生长发育。本研究克隆得到GATA锌指结构转录因子SsAms2,使用RNAi技术对核盘菌中SsAms2基因进行沉默,通过分析其在生长发育和致病方面的差异变化,探究SsAms2基因的功能,揭示生长发育中的分子机制,为防治菌核病提供理论依据,探究新的防治思路。12 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化本实验在核盘菌基因组数据库中得到一个转录因子,通过生物信息学分析,该基因编码的蛋白含有GATA锌指结构域(CX2CX17-20CX2C),该转录因子与裂殖酵母中一个调控组蛋白基因转录的蛋白Ams2同源,将该基因命名为SsAms2。本实验室保存有RNAi载体pSilent-Dual1,使用RNAi技术,将SsAms2基因的两个相互无重叠的靶序列连接至RNAi载体pSilent-Dual1,分别构建重组质粒,并使用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将重组质粒分别转入核盘菌原生质体,将核盘菌中的该基因沉默表达,使用抗性筛选的方法筛选获得沉默突变体。通过PCR检测抗性基因并使用Real-timePCR验证基因沉默效率,验证SsAms2基因沉默转化子。1实验材料1.1菌株、载体及引物核盘菌野生型菌株S.sclerotiorum1980UF-70,大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α,RNAi载体pSilent-Dual1。1.2主要仪器PCR仪(Bio-Rad,USA),琼脂糖凝胶电泳仪,凝胶成像仪,高压灭菌锅,无菌操作台,金属浴,水浴锅,恒温光照培养箱,分析天平,pH计,超低温冰箱,微量移液器,台式离心机,低温离心机,恒温振荡培养箱,荧光定量PCR仪(StepOneReal-TimePCR)。1.3主要试剂KODPlusNeo(购自Toyobo公司);限制性内切酶HindⅢ,T4DNAligase,PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser,SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus)(购自Takara公司);LB肉汤培养基,肝素钠,亚精胺(购自Solarbio公司);质粒小提试剂盒,琼脂糖凝胶回收试剂盒,大肠杆菌DH5α感受态细13 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化胞(购自天根公司);TransZolUpPlusRNAKit(购自全式金公司);Estaqmastermix(购自康维世纪);琼脂粉,葡萄糖,PEG4000,蔗糖,无水CaCl2,NaOH,KCl,Mg2SO4·7H2O,K2HPO4,柠檬酸钠,山梨醇,乙酸,Tris,EDTA,琼脂糖(购自生工生物);氨苄青霉素,遗传霉素,Lysing裂解酶(购自Sigma-Aldrich);盐酸,无水乙醇,氯仿,酵母浸粉(购自金泰化玻)。1.4培养基及试剂配制1.4.1马铃薯琼脂培养基(PDA培养基)配制方法(1L)马铃薯去皮,称取200g切成方形小块,加入适量水煮15-20min,使用三层纱布过滤,留下滤液,加入15-20g琼脂,20g葡萄糖,补水至1L,分装于三角瓶中,待高压灭菌后备用。1.4.250×TAE电泳缓冲液配制方法(1L)量取冰醋酸57.1mL,使用天平称取Tris242g,EDTA37.2g,加ddH2O定容至1L,调节pH值至8.0,储存备用。1.4.3YPSu培养基配制方法(1L)称取酵母浸粉4g,蔗糖15g,Mg2SO4·7H2O0.5g,K2HPO41g,调pH值至6.5,加入ddH2O定容至1L,高压灭菌备用。1.4.4核盘菌原生质体制备与转化相关培养基与缓冲液配制方法(1)RM上层培养基(100mL):称取蔗糖23.96g,酵母浸粉0.05g,加入ddH2O定容至100mL,加入琼脂粉0.8g,灭菌备用。(2)RM下层培养基(1L):称取蔗糖239.6g,酵母浸粉0.5g,加入ddH2O定容至1L,加入琼脂粉15g,灭菌备用。(3)原生质体缓冲液(Protoplastbuffer):终浓度0.8MMgSO4·7H2O,0.2M柠檬酸钠,使用ddH2O定容,调pH值至5.5,高压蒸汽灭菌。(4)Novozymebuffer:终浓度50mM柠檬酸钠,1M山梨醇,使用ddH2O定容,调pH值至5.5,高压蒸汽灭菌。(5)STC:终浓度1M山梨醇,50mMCaCl2·2H2O,50mMTris-HCl(pH=8.0),使用ddH2O定容,高压蒸汽灭菌。(4)KTC:终浓度1.8MKCl,150mMCaCl2,150mMTris-HCl(pH=8.0),14 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化使用ddH2O定容,高压蒸汽灭菌。(5)0.6MKCl(100mL):称取60gKCl,加ddH2O定容至100mL,高压蒸汽灭菌。(6)60%PEG溶液:称取PEG400060g,加入适量ddH2O中,放入60℃水浴中使其溶解,待完全溶解后,加入ddH2O定容至100mL,高压蒸汽灭菌。(7)40%PEG溶液:将60%PEG溶液与KTC溶液按2:1的混合备用。1.4.5核盘菌基因组DNA提取相关溶液(1)100mMTris-HCl(pH=8.0,100mM):称取Tris1.576g,溶于100mMddH2O中,使用0.1M盐酸溶液调pH值至8.0,使用孔径为0.45μm的灭菌滤器过滤除菌。(2)CTAB:量取20mL1MTris-HCl(pH=8.0),56mL5MNaCl,8mL0.5MEDTA(pH=8.0),称取4gCTAB,溶解后使用ddH2O定容至200mL,调pH值至8.0,高压蒸汽灭菌备用;2实验方法2.1SsAms2基因克隆2.1.1野生型核盘菌总RNA提取及反转录用于收集和提取核盘菌RNA的所有工具,包括镊子,研钵,药匙等在使用前置于180℃烘箱中处理5h以上,所使用的耗材均购置于生物公司,确保无菌且无RNA酶污染,RNA提取方法根据TransZolUpPlusRNAKit说明。(1)将4℃中保存的核盘菌野生型菌种接种于90mm直径PDA培养平板中,置于25℃培养基中培养,2天后使用5mm打孔器在生长状态良好的核盘菌菌落边缘打取菌饼,接种于表面铺好灭菌玻璃纸的PDA平板中,置于25℃培养箱中进行培养,待核盘菌生长2-3d后,使用镊子收集玻璃纸表面的菌丝,将菌丝包裹于铝箔纸中,置于液氮中速冻,取出后,保存于-80℃冰箱备用;(2)将菌丝组织迅速转移至液氮预冷的研钵中,使用研钵充分研磨至菌丝组织成粉状,在研磨期间保证菌丝组织一直保持低温状态;15 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化(3)在离心管中加入1mLTransZolUp,每管中加入50-100mg研磨成粉状的样品,充分震荡混匀样品,室温静置5min;(4)加入200µL的氯仿,剧烈震荡30s,置于室温下静置3min;(5)在预冷至4℃的低温离心机中10000×g离心15min,小心吸取上层无色水相液体至新的离心管中,加入等体积的无水乙醇,轻轻颠倒混匀,此时可能出现沉淀,将得到的溶液和沉淀加入离心柱中,12000×g室温离心30s,弃掉收集管中的废液。(6)向离心柱中加入500µL的CB9,12000×g室温离心30s,弃掉收集管中的废液,重复一次,加入500µL的WB9,12000×g室温离心30s,弃掉收集管中的废液,重复一次;(7)空柱12000×g室温离心2min,室温静置10min晾干离心柱,将离心柱放置于,RNase-freeTube中,向离心柱中加入50µL的RNase-freewater,室温静置2min后,12000×g室温离心1min。(8)使用Takara公司的PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser对RNA进行反转录得到核盘菌野生型总cDNA。2.1.2SsAms2目的片段序列的获得在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)网站上检索获得SsAms2的基因序列,使用引物设计软件PrimerPremier6.0设计SsAms2基因片段的引物,引物序列见表2.1。表2.1引物序列Table.2.1Primersandsequence引物名称引物序列备注pSD1-T1-FCCCAAGCTTACGCAATGACCTCAGATTCForwardprimerofSsAms2target1withHindⅢpSD1-T1-RCCCAAGCTTCTCCTTGTTCATCGTTCCAReverseprimerofSsAms2target1withHindⅢpSD1-T2-FCCCAAGCTTCTCAAACAGTTCCACCAATGForwardprimerofSsAms2target2withHindⅢpSD1-T2-RCCCAAGCTTCGTCTTCCCCTCTTCACAReverseprimerofSsAms2target2withHindⅢ2.1.3PCR扩增SsAms2基因目的片段以核盘菌野生型cDNA为模板,用设计好的SsAms2基因引物pSD1-T1-F/16 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化pSD1-T1-R,pSD1-T2-F/pSD1-T2-R分别扩增target1和target2序列,PCR扩增体系见表2.2,PCR反应条件:94℃2min;98℃10s,56℃30s,68℃30s,29个循环;68℃7min;16℃forever。表2.2PCR扩增反应体系Tab.2.2PCRamplificationsystem组成终浓度/50μL10×KODBufferforKOD-Plus-Neo1×2mMdNTPs0.2mM25mMMgSO41.5mM模板cDNA200ng/50μL引物1(10mM)0.15μM引物2(10mM)0.15μMKODDNApolymerase(1U/μL)1U/50μlddH2O--PCR扩增结束后,在1%琼脂糖凝胶中电泳,检测PCR产物,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒对目的条带进行回收,溶于30µl无菌水中,保存备用。2.2SsAms2RNAi载体构建本实验室保存有沉默载体pSilent-Dual1(pSD1),该载体带有两个反向的丝状真菌启动子PtrpC和Pgpd,并带有遗传霉素筛选抗性,将目的片段Target1和Target2插入两个启动子之间可以转录产生双链RNA(图2.1)。17 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化AB图2.1SsAms2RNAi载体构建。A:pSilent-Dual1载体质粒图谱,B:RNAi载体构建策略。Fig.2.1ConstructionofSsAms2RNAinterferenceplasmid.A:pSilent-Dual1plasmidprofiles,B:RNAinterferenceplasmidconstructionstrategy.18 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化用限制性内切酶HindⅢ对SsAms2target1,SsAms2target2片段和载体质粒pSD1同时进行单酶切,酶切体系见表2.3;用1%琼脂糖凝胶电泳检测,用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段和酶切后线性化载体片段pSD1。表2.3DNA片段和质粒酶切体系Tab.2.3Restricionenzymedigestionsystemoffragmentsandplasmid成分终浓度/50μL10×BufferM1×0.1%BSA0.01%HindⅢ2.5μL/50μLSsAms2fragments/pSD12.5μg/50μL水--将回收后的目的片段与线性pSD1片段在16℃条件下连接过夜,构建重组质粒pSD1-SsAms2target1/target2,连接体系见表2.4;将重组质粒加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,冰上放置20分钟,42℃热激90秒,冰上放置3分钟后加入700μL的LBfree中,置于恒温摇床中,37℃,200rpm震荡培养1小时,5000rpm离心1分钟后使菌体沉淀于离心管底部,使用移液器吸出500μLLB培养基,吸打剩余的液体,使菌体重悬,并将重悬菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养平板上。37℃培养16h后挑取单菌落于含氨苄青霉素筛选抗性(50μg/mL)的液体LB培养基中,于37℃,200rpm摇床中震荡培养4-5h,进行菌液PCR验证,PCR扩增体系见表2.5。反应条件:94℃3min;94℃30sec,56℃30sec,72℃30sec,29个循环;72℃10min;4℃forever。选择验证阳性的菌株加入10mL含氨苄青霉素霉素筛选抗性(50μg/mL)的液体LB培养基中进行扩大培养。19 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化表2.4重组质粒连接体系Tab.2.4Ligationsystemofrecombinedplasmid成分体积(μL)目的片段2线性载体片段610×T4DNA连接酶Buffer1T4DNA连接酶1表2.5菌液PCR验证体系Tab.2.5PCRamplificationverificationsystem组成体积(μL)2×Estaqmastermix5μL引物1(10mM)0.25μL引物2(10mM)0.25μL模板1μLddH2O3.5μL使用质粒提取试剂盒提取重组质粒,并进行酶切验证,酶切体系见表2.6,琼脂糖凝胶电泳检测。选取酶切验证结果正确的质粒进行测序。表2.6酶切验证体系Tab.2.6Restricionenzymedigestionsystemofrecombinedplasmid成分终浓度/10μL10×BufferM1×0.1%BSA0.01%HindⅢ0.5μL/10μLSsAms2fragments/pSD10.5μg/10μL水--20 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化2.3核盘菌遗传转化及SsAms2沉默转化子的筛选2.3.1野生型核盘菌原生质体制备(1)将野生型核盘菌菌株接种于PDA培养基平板中活化,2天后,使用打孔器在菌落边缘打取菌丝块,将菌丝块菌丝面朝上接种于直径90mm培养皿中,每个培养皿中接种3个菌饼,向培养皿中轻轻倒入YPSu液体培养基,使培养基液面与菌丝面处于同一水平面,置于25℃培养箱中培养2-3天;(2)菌丝刚刚铺满培养基时用镊子将菌丝体取出,除去菌丝块,使用无菌ddH2O冲洗两次,再用1×原生质体缓冲液漂洗两次。用镊子将菌丝体撕碎后加入150mL三角瓶中;(3)3mlNovozymebuffer里溶解400-600mgLysing酶(6ml-9mlNovozymebuffer),使用灭菌的0.45μm滤头抽滤除菌;(4)向Lysing酶溶液中加入17ml原生质体缓冲液,将混合溶液加入上述撕碎的的菌丝体中。置于100rpm,28℃恒温摇床中震荡2-4小时,2小时后每隔30分钟进行镜检,待菌丝完全裂解,细胞状态最好时进行下一步实验;(5)使用40μm的细胞筛将菌丝过滤于50mL灭菌离心瓶中,加入30ml0.6M的KCl,混匀后,4℃,3000×g离心10min;(6)弃掉离心上清液,加入10mLSTC在冰上重悬沉淀,4℃,3000×g离心10min,重复一次;(7)弃去离心上清液,用1mlSTC悬浮原生质体,镜检,使用血球计数8板计数,使其达到1×10个/ml,如果很浓再加STC稀释;(8)每1ml原生质体悬浮液中加入12.5µLDMSO,62.5µL肝素钠(5mg/mLinSTC),250µL40%PEG,每管100µL分装保存于-80℃冰箱。2.3.2PEG-CaCl2介导核盘菌原生质体转化(1)取5µg构建好的RNAi重组质粒,体积应小于所使用的原生质体溶液的十分之一,肝素钠5µL,亚精胺5µL,加入50µL的原生质体中,使用移液器轻轻吸打混匀,冰上放置30min;(2)加入1mL40%PEG溶液,轻轻吸打混匀,室温放置20min;(3)将上述混合液吸至不加抗性的RM下层培养基(25mL)中央,轻轻21 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化旋转倾斜使其铺满培养基;(4)将培养基置于25℃,黑暗培养约15h,待液体彻底干后,将5mL含有600µg/mL浓度遗传霉素的RM上层培养基平铺于RM培养基上,使整个培养基遗传霉素终浓度为100µg/mL,25℃培养4-7d。2.3.3抗性筛选SsAms2基因沉默转化子使用手术刀切取RM上层培养基上长出的核盘菌菌丝尖端,将其接种于预先配制好的含有100µg/mL遗传霉素的PDA培养基上,置于25℃培养箱中培养,待其生长产生菌丝后再次切取菌丝尖端接种于新的含有100µg/mL遗传霉素的PDA培养基上,每株菌株筛选三次以上。将筛选得到的遗传转化子接种于PDA斜面上,置于4℃冰箱中保存。2.3.4快速PCR筛选SsAms2沉默转化子将上述筛选得到的转化子接种于PDA培养基上进行培养,2d后使用直径5mm打孔器打取核盘菌菌落边缘3个菌丝块,将菌丝块置于1.5mL离心管中,放入液氮速冻,向菌丝块中加入300µL0.5M的NaOH,12000rpm室温离心10min。取上清液5µL与45µL100mM的Tris-HCl(pH=8.0)充分混匀。取1µL混合液作为模板,根据遗传霉素序列设计遗传霉素的引物,进行PCR检测,PCR扩增体系见表2.7,反应条件:94℃3min;94℃30sec,56℃30sec,72℃30sec,29个循环;72℃10min;16℃forever。遗传霉素引物序列:G418-F:TGTCCGGTGCCCTGAATGAACTG418-R:GCCGCCAAGCTCTTCAGCAATAT表2.7菌液PCR验证体系Table.2.7PCRamplificationverificationsystem组成体积(μL)2×Estaqmastermix5μLG418-F(10mM)0.25μLG418-R(10mM)0.25μL模板1μLddH2O3.5μL22 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化2.4SsAms2沉默转化子的验证2.4.1PCR检测SsAms2沉默转化子(1)CTAB法提取核盘菌野生型及转化子的基因组DNA1)将核盘菌接种于铺好灭菌玻璃纸的PDA平板上,待菌丝生长至培养皿边缘时,收集菌丝体,加入液氮,在预冷的研钵中研磨至粉状;2)在1.5mL离心管中加入600μL预热的CTAB,将研磨至粉状的菌丝体加入CTAB中,充分混匀,置于65℃水浴中1h,其间每隔10-15min颠倒混匀。3)向混合液中加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),剧烈震荡至液体变为均匀乳白色,室温12000rpm离心15min;4)离心后溶液分层,吸取上清液至新的离心管中,重复上一步骤5)吸取上清液至新的离心管,加入2倍体积的异戊醇,混匀后置于-80℃冰箱中沉淀30min;6)4℃,12000rpm离心15min,此时离心管底部可能出现沉淀,弃掉上清液,加入1mL75%乙醇,将底部沉淀弹起,清洗沉淀,12000rpm离心10min,弃掉上清液,并尽量将液体吸干;7)将带有沉淀的离心管放入真空干燥离心机中离心10min,此时酒精完全挥发,加入50μLddH2O溶解沉淀DNA,保存于-20℃备用。(2)使用表2.7中的引物,以野生型和转化子DNA为模板,PCR验证遗传霉素基因,pSD1为模板做阳性对照,反应条件:94℃3min;94℃30sec,56℃30sec,72℃30sec,29个循环;72℃10min;16℃forever。反应体系见表2.8。2.4.2沉默转化子SsAms2基因表达量验证将PCR初步验证正确的SsAms2沉默转化子及野生型核盘菌接种于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上,2-3d后菌丝刚好长满PDA平板时使用镊子收集菌丝体,使用2.1.1节中介绍的方法提取转化子及野生型核盘菌的总RNA,并将RNA反转录为cDNA,根据SsAms2基因序列设计qRT-PCR特异性引物,β-actin基因作为内参,以cDNA为模板,使用SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus)进行qRT-PCR实验检测沉默转化子表达量,反应体系见表2.8,反应条件:95℃23 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化30s;95℃5s,60℃34s,40个循环;95℃15s,60℃1min,95℃15s。每个实验组三次重复。SsAms2基因qRT-PCR引物:qSsAms2-F:CCACCTCGTATCTCCTCATqSsAms2-R:GGCATAGTAGTAGCAACCTTAActin-F:GAATGTGTAAGGCCGGTTTCGCActin-R:CATCCCAGTTGGTGACGACACC表2.8qRT-PCR反应体系Tab.2.8qRT-PCRamplificationsystem组成体积(μL)2×SYBRPremixExTaq6μLROXReferenceDye0.24μL引物1(10mM)0.25μL引物2(10mM)0.25μLcDNA1μLddH2O4.26μL3结果与分析3.1SsAms2生物信息学分析3.1.1SsAms2基因序列分析结果在NCBI数据库中检索SsAms2基因进行生物信息学分析,该基因全长3713bp,含两段内含子,mRNA全长3606bp,编码蛋白质全长1201aa。通过蛋白质保守结构域预测分析(图3.1),在氨基酸序列的728-831区域包含一个GATA锌指结构域,该类转录因子在真菌中已有不少研究,能够调控氮元素,铁元素代谢,调控菌丝生长,交配型,生物节律,菌核,子囊盘以及侵染垫的形成,并且与致病性相关,在真菌有性和无性发育中具有重要调控作用。此外在上游还包含一个Atrophin-1家族结构域,Atrophin-1在人类中为齿状核红核24 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化苍白球路易体萎缩症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy,DRPLA)基因编码蛋白,在真菌中还未有功能预测及研究。图3.1SsAms2保守结构域预测分析Fig.3.1ConserveddomainsanalysisofSsAms23.1.2SsAMS2转录因子进化分析在NCBI数据库中对SsAMS2蛋白序列进行BLAST,并进行SmartBLAST序列分析(图3.2),在模式生物斑马鱼(Daniorerio),人类(Homosapiens),家鼠(Musmusculus),果蝇(Drosophilamelanogaster)以及裂殖酵母(S.pombe)中均有与SsAMS2同源的蛋白,其中裂殖酵母中的转录因子Ams2与SsAMS2具有较高的同源性。图3.2NCBISmartBLAST结果Fig.3.2NCBISmartBLASTanalysis对SsAMS2氨基酸序列进行BLAST分析,选取9个真菌物种的相关蛋白,这些物种中的同源蛋白已有测序分析以及功能预测,利用MEGA7.0软件进行序列比对,构建系统进化树(图3.3),根据多序列比对结果,不同物种的同源基因之间的GATA结构域存高度同源,根据系统进化树,SsAMS2与灰霉菌(Botrytiscinerea)BC1G_06801和冠盘二胞(Marssoninacoronariae)Ams2同源性最高。在裂殖酵母(S.pombe)中,对转录因子Ams2已有大量研究,核25 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化盘菌中的SsAMS2与裂殖酵母中的Ams2也有较高的同源性。AB图3.2SsAMS2与其他真菌物种系统进化分析及同源蛋白序列比对。A:通过MEGA7.0,构建了核盘菌SsAMS2与其他9个真菌物种中的同源蛋白的进化树,核盘菌SsAMS2标注为▲,B:通过Bioedit,进行了核盘菌SsAMS2与其他9个真菌物种中的同源蛋白多重序列比对。Fig.3.2PhylogeneticanalysisandalignmentwithhomologousproteinsofSsAMS2.A:PhylogenetictreederivedfromninehomologousproteinsinfungispeciesbyMEGA7.0,SsAMS2markedwith▲.B:ThemultiplealignmentanalysisofninehomologousproteinsinfungispeciesbyBioedit.3.2PCR验证沉默转化子3.2.1PCR检测遗传霉素基因以SsAms2沉默转化子的DNA为模板,使用遗传霉素引物对遗传霉素进行PCR扩增,野生型核盘菌模板作为阴性对照,pSD1质粒作为阳性对照,PCR扩增后电泳检测,结果如图3.1:26 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化650bp图3.1遗传霉素基因PCR检测结果M:DL1000Marker;1:pSD1质粒(阳性对照);2:核盘菌野生型(阴性对照);3-8:SsAms2沉默转化子转化子遗传霉素PCR检测结果;Fig.3.1PCRverificationofgeneticingeneM:DL1000Marker;1:pSD1plasmid(positivecontrol);2:Wildtype(negativecontrol);3-8:PCRverifyinggeneticingeneofSsAms2silencedtransformants根据PCR检测遗传霉素基因的结果,SsAms2沉默转化子均扩增得到遗传霉素条带,阳性对照pSD1沉默载体质粒扩增也得到了对应的条带,条带位置为650bp,野生型核盘菌作为阴性对照在对应位置未扩增得到相应条带。根据以上PCR结果,可以初步确定RNAi重组质粒已经转入核盘菌细胞内。3.2.2qRT-PCR检测SsAms2基因表达量通过PCR初步验证,重组质粒已转入转化子细胞中,为了验证SsAms2基因表达是否被沉默,以β-actin基因为内参基因,进行qRT-PCR实验,检测沉默转化子相对于野生型的基因表达量,实验结果如图3.2。图3.5野生型核盘菌和沉默转化子的转化子SsAms2基因表达量Fig.3.5RelativeexpressionofSsAms2inwildtypestrainandtransformants27 第二章SsAms2基因克隆、载体构建及其遗传转化通过PCR初步检测重组质粒转入细胞后,进行qRT-PCR实验,结果表明基因SsAms2在筛选得到的沉默转化子中的表达量均有明显下降,使用基因SsAms2的两个没有重叠的靶序列分别进行基因沉默,均了得到了表达量下降的转化子,且相对于野生型的表达量下降至0.5左右。4小结通过PEG-CaCl2介导的核盘菌原生质体转化,将pSD1-SsAms2-Targrt1和pSD1-SsAms2-Targrt2连接两个靶点序列的重组质粒分别转入核盘菌原生质体细胞中。通过菌丝尖端切除,使用遗传霉素抗性培养基对转化子进行筛选。提取沉默转化子的总DNA,使用DNA为模板扩增遗传霉素抗性基因,得到转入重组质粒的沉默转化子,对克隆得到正确条带的阳性转化子提取总RNA进行qRT-PCR实验,检测SsAms2基因的表达量,结果表明,每个靶点序列选取的三个转化子SsAms2基因表达量均有不同程度的下降。根据以上结果,构建的RNAi重组质粒成功转入核盘菌细胞中,并对SsAms2基因进行了沉默导致表达量下降,为研究SsAms2基因在核盘菌中的功能,需要对转化子生长,发育以及致病等方面的表型变化方面进行下一步实验与分析。28 第三章转录因子SsAMS2的功能验证第三章转录因子SsAMS2的功能验证本实验中通过对基因SsAms2的RNAi得到沉默转化子,基因表达量有了显著的下调趋势。本章中对沉默转化子的菌落形态、菌核及侵染垫生长、菌丝形态、草酸生成、耐活性氧及高盐环境、细胞核数量等方面进行了形态学观察,通过与野生型核盘菌表型差异分析转录因子SsAMS2在核盘菌生长发育以及致病中的作用。1实验材料1.1菌株、载体及引物核盘菌野生型菌株S.sclerotiorum1980UF-70,RNAi沉默转化菌株。1.2主要仪器微单相机(索尼ILCE-6000),倒置荧光显微镜(尼康TS2R-FL),实体显微镜,荧光定量PCR仪(StepOneReal-TimePCR),恒温光照培养箱,高压灭菌锅,恒温振荡培养箱,微量移液器,无菌操作台,分析天平。1.3主要试剂SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus)(购自Takara公司);琼脂粉,葡萄糖,NaCl,KCl,溴酚蓝(购自生工生物);30%过氧化氢(购自金泰化玻)。1.4培养基及试剂配制马铃薯琼脂培养基(PDA培养基),YPSu培养基,核盘菌原生质体制备相关培养基与缓冲液配制方法见第二章。DAPI(4,6-diamino-2-phenylindole)溶液母液配制(20mL):称取DAPI2mg,使用20mLddH2O溶解,配制成100μg/mL的溶液,待粉末完全溶解后,使用灭菌的0.45μm灭菌滤头抽滤灭菌,将灭菌后的DAPI母液1mL每管分装,使用铝箔纸包裹避光,保存于-20℃冰箱中。29 第三章转录因子SsAMS2的功能验证2实验方法2.1沉默转化子菌落形态观察将保存于斜面的沉默转化子和野生型菌株接种于PDA平板上,置于25℃恒温培养箱中活化培养,2d后使用直径5mm打孔器打取菌落边缘,菌丝面向下接种于PDA平板中央,置于25℃培养箱中培养,在生长3天及2周后观察菌落形态,将发育成熟的菌核取下,置于空培养皿中,在30℃烘箱中放置3天烘干,在分析天平上称取菌核总重量,每个菌株进行三次重复实验。2.2沉默转化子生长速率测定使用5mm打孔器打取活化好的沉默转化子及野生型核盘菌菌落边缘,菌丝面向下接种至90mmPDA平板中央,置于25℃培养箱中培养。使用十字交叉法,在生长24h,36h,48h,60h,72h时测量菌落直径,统计分析数据,对数据进行绘图处理,每个菌株进行三次重复试验。2.3沉默转化子菌丝形态及分枝观察(1)选取无划痕的载玻片,清洗后置于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理,使用时使用无水乙醇浸泡,取出后在酒精灯上以火焰去乙醇;(2)将载玻片插入已倒好的PDA平板中,取活化好的沉默转化子以及野生型核盘菌菌块接种至PDA培养基上;(3)待生长2-3d后,菌丝从PDA培养基上生长至载玻片上,将载玻片从培养平板上取下,置于显微镜下对菌丝形态进行观察,每组实验重复三次。2.4沉默转化子侵染垫形成观察(1)将无划痕的载玻片清洗干净置于75%乙醇中浸泡,使用时使用镊子将载玻片取出置于酒精灯上去乙醇,待冷却后可使用;(2)在灭菌的培养皿中放入无菌的移液器吸头,将载玻片放置于移液器吸头上,培养皿中加入适量无菌水,液面高度不高于载玻片水平面;(3)将活化好的沉默转化子以及野生型核盘菌使用直径5mm打孔器打孔,30 第三章转录因子SsAMS2的功能验证菌丝块的菌丝面向下接种于载玻片中央,生长16h后,在显微镜下观察菌丝尖端分化产生侵染垫情况,生长3-4d后,观察菌丝块周围侵染垫的形成情况,每个菌株进行三次重复试验。2.5沉默转化子草酸分泌测定2.5.1溴酚蓝培养基接种测定(1)溴酚蓝是一种酸碱指示剂,当pH值大于4.6时呈蓝色,当pH值低于3.0时呈黄色。使用ddH2O将溴酚蓝配置成5mg/mL的母液,待溴酚蓝完全溶解后,使用0.45μm灭菌滤头进行过滤除菌;(2)向PDA培养基中加入溴酚蓝溶液,配制成为100μg/mL溴酚蓝的PDA培养基,使用打孔器打取转化子以及野生型菌饼,接种于配置好的溴酚蓝PDA培养基培养平板中,两天后观察,每组实验重复三次。2.5.2沉默转化子培养基pH值测定(1)向200mL三角瓶中倒入100mLYPSu培养基,使用打孔器打取沉默转化子及野生型核盘菌菌饼,将菌饼菌丝面朝上轻轻放入YPSu液体培养基中,使菌饼悬浮于培养基表面,置于25℃培养基中进行培养;(2)培养3d后,使用精密pH试纸进行测定,野生型核盘菌使用精密pH试纸范围为2.7-4.7,沉默转化子使用精密pH试纸范围为3.8-5.4,每组实验重复三次。2.6沉默转化子的致病力测定(1)将草炭土与蛭石按2:1的比例混合,进行高压蒸汽灭菌,将菜豆种子置于铺有湿润滤纸的培养皿中进行催芽萌发处理,待菜豆种子出芽后将种子种植于灭菌土壤中;(2)待菜豆生长7周后,剪取生长状态一致的叶片,将纱布平铺于15cm直径培养皿中,喷洒适量无菌水润湿纱布,每个培养皿内放三片叶片,其中一些叶片使用针刺透叶片进行创伤处理;(3)将活化好的沉默转化子以及野生型核盘菌使用5mm打孔器打取菌饼,将菌饼分别接种于未创伤和创伤的菜豆叶片上,置于室温培养3d后观察叶片病31 第三章转录因子SsAMS2的功能验证斑大小,计算病斑面积,每个实验进行三次重复。2.7沉默转化子抗活性氧及高盐测定2.7.1沉默转化子抗活性氧测定(1)将PDA培养基融化,待冷却至50℃以下后,向PDA培养基中加入不同体积的30%过氧化氢,配成浓度为5mM,15mM,25mM,35mM的PDA培养基。(2)使用打孔器打取沉默转化子及野生型核盘菌的菌饼,将菌饼接种至不同浓度梯度的过氧化氢平板中,置于25℃培养基中培养,两周后观察转化子与野生型的生长状态区别,每组实验重复三次。2.7.2沉默转化子抗高盐测定配制浓度为1M的含NaCl,KCl培养基,高压蒸汽灭菌。使用打孔器打取沉默转化子及野生型核盘菌的菌饼,将菌饼接种至1MNaCl,1MKCl培养平板中,置于25℃培养基中培养,三天后观察转化子与野生型的生长状态区别,每组实验重复三次。2.8沉默转化子菌丝细胞核测定(1)选取无划痕的载玻片,清洗后置于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理,使用时使用无水乙醇浸泡,取出后在酒精灯上以火焰去乙醇;(2)将载玻片插入已倒好的PDA平板中,取活化好的沉默转化子以及野生型核盘菌菌块接种至PDA培养基上;(3)待生长2-3d后,菌丝从PDA培养基上生长至载玻片上,将载玻片从培养平板上取下;(4)使用第二章所述实验方法制备沉默转化子以及野生型核盘菌的原生质体,将100μl原生质体涂布于RM下层培养基上,置于黑暗中培养,16h后在培养基表面可看到绒毛状的菌丝长出,使用手术刀将生长有菌丝的培养基切出置于载玻片上;(4)使用1×PBS缓冲液将配置好的DAPI溶液稀释1000倍,配置成终浓度为100ng/mL的DAPI溶液,使用微量移液器吸取25μL的DAPI溶液,滴于32 第三章转录因子SsAMS2的功能验证载玻片上的菌丝处,盖上盖玻片,置于黑暗中染色30min后,在荧光显微镜下观察菌丝细胞核形态,并统计细胞核数量。2.9组蛋白基因及细胞分裂相关基因表达量分析SsAMS2在裂殖酵母中的同源蛋白Ams2在调控组蛋白基因转录起始过程中有重要作用,因此在核盘菌基因组数据库中检索组蛋白基因H2A(SS1G_10959),H2B(SS1G_10960),H3(SS1G_09608),H4(SS1G_09609),得到基因序列,并设计qRT-PCR引物。根据String蛋白网络数据库(https://string-db.org)预测分析,SsAMS2与组蛋白H3变异体基因SS1G_00304编码蛋白,以及细胞分裂相关蛋白Cdc6(SS1G_04516),Cdc28(SS1G_02296)具有相互作用,核盘菌中SS1G_00304基因与裂殖酵母中的cnp1同源,根据以上基因序列设计qRT-PCR引物,引物序列见表3.1。使用已提取的沉默转化子以及野生型核盘菌菌株的cDNA,进行qRT-PCR,检测对应基因在沉默转化子中的相对表达量。反应条件:95℃30s;95℃5s,60℃34s,40个循环;95℃15s,60℃1min,95℃15s。每个实验组三次重复。表3.1qRT-PCR引物序列Table.3.1PrimersandsequenceofqRT-PCR引物名称引物序列HistoneH2AQFTTCGCAATGTGTTCTCAATCHistoneH2AQRATGACTCACCAGCACCAAHistoneH2BQFGGAGACTTACTCTTCATACATCHistoneH2BQRTGGACTTGCTTGAGAACTATHistoneH3QFGGCTCGTACCAAGCAAACTGHistoneH3QRGAAGTCTTGGGCGATTTCACHistoneH4QFCTCTCACCGTCATTCAGTTHistoneH4QRTTATGCCTTGGATGTTGTCTcnp1QFTATCGCTGGAAGAAGAATCAcnp1QFGCTTACCTCTAACGGCAATCdc6QFCGATGCCGATTCTATGGACdc6QRGTTCTTGGTAATGCGATTCTCdc28QFCGAGGCTGAAGATGAAGGCdc28QRCGTGAACGATATTAAGGAGTC33 第三章转录因子SsAMS2的功能验证3结果与分析3.1沉默转化子菌落形态将5mm的沉默转化子以及野生型核盘菌菌饼接种于PDA培养基,在25℃恒温培养箱中进行培养,分别于培养3天及2周时对菌落形态进行观察,比较分析转化子与野生型在生长速率,菌核形成,菌落形态等方面的差异,菌落形态见图3.1。WTSsAms2-T1-93SsAms2-T1-98SsAms2-T1-17SsAms2-T2-202SsAms2-T2-102SsAms2-T2-108图3.1沉默转化子及野生型菌落形态Fig.3.1Colonialmorphologyoftransformantsandwildtype核盘菌WT(wildtype)为野生型核盘菌,SsAms2-T1-93、SsAms2-T1-98、SsAms2-T1-17为使用Target1进行RNAi得到的沉默转化子,SsAms2-T2-202、SsAms2-T2-102、SsAms2-T2-108为使用Target2进行RNAi得到的沉默转化子。在生长3天和2周时对核盘菌菌落形态进行观察,转化子的菌落形态相对于野生型均有明显变化,且两个靶序列分别进行RNAi得到的沉默转化子的表型一致。转化子在生长速率方面显著变慢,在生长至2周时菌落仍未铺满直径90mm的PDA平板,能够形成菌核但形成速度变慢。根据沉默转化子菌落形态的变化,表明SsAms2参与调控核盘菌的菌丝生长。3.2沉默转化子菌核形成在90mm的PDA培养平板上接种的核盘菌转化子以及野生型生长至两周后菌核发育成熟,将培养平板中的所有菌核取下并烘干,使用分析天平测量菌34 第三章转录因子SsAMS2的功能验证核干重,比较沉默转化子及野生型核盘菌在菌核形态,重量方面的差异。如图3.2A为菌核形态,图3.2B为菌核重量统计柱形图。AWTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17BC图3.2沉默转化子及野生型核盘菌菌核形成差异。A:沉默转化子及野生型核盘菌菌核形态特征,B:沉默转化子及野生型核盘菌菌核重量差异,C:沉默转化子及野生型核盘菌菌核数量差异Fig.3.2Differentsclerotiaformationbetweentransformantsandwildtype.A:Sclerotiamorphologyofthetransformantsandwildtype,B:Sclerotiaweightofthetransformantsandwildtype,C:Sclerotianumbersofthetransformantsandwildtype.相对于野生型核盘菌,沉默转化子菌核形成速度变慢,菌核形成滞后,但在菌核大小上未有显著变化。在最终形成的菌核总重量上相对于野生型均较轻,形成数量减少,说明SsAms2在核盘菌的菌核形成方面有一定调控作用。35 第三章转录因子SsAMS2的功能验证3.3菌丝生长速率测定将沉默转化子SsAms2-93,SsAms2-98,SsAms2-17和野生型核盘菌打取5mm菌饼接种于PDA平板中,置于25℃条件下进行培养,在24h,36h,48h,60h,72h时使用十字交叉法测量菌落直径,进行三次重复,计算测量数据的平均值,绘制折线图,结果见图3.3。图3.3沉默转化子及野生型核菌丝生长情况Fig.3.3Mycelialgrowthoftransformantsandwildtype根据实验结果,沉默转化子的菌丝生长速率明显较慢,在野生型生长至48h时,菌落已经长满9cm直径的PDA平板,而转化子在48h时菌落直径仅为3.5cm左右,在生长至72h时,转化子的菌落直径显著小于野生型。转化子SsAms2-93的生长速率抑制效果最低,生长速率相对于野生型降低最少,同时SsAms2-93转化子中基因的表达量下降也相对最低,基因表达量的抑制与菌丝生长速率的下降呈现一致的趋势。说明SsAms2在调控菌丝生长和发育过程中起到重要作用,3.4沉默转化子菌丝形态及分枝观察将灭菌的载玻片插入PDA培养基中,将沉默转化子以及野生型核盘菌接种于PDA培养基上,待核盘菌菌丝生长至载玻片中后,取下载玻片置于光学显微镜下,观察沉默转化子的菌丝形态及分枝状态相对于野生型核盘菌的差别,观36 第三章转录因子SsAMS2的功能验证察结果见图3.4。WTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17图3.4沉默转化子及野生型核盘菌菌丝显微观察Fig.3.4Hyphalmicroscopicobservationoftransformantsandwildtype根据菌丝分枝形态的显微观察,沉默转化子的分枝与野生型有显著区别,沉默转化子的菌丝分枝出现直角分枝较多,同时生长出短小的菌丝,而野生型核盘菌的菌丝分枝为锐角分枝,且各分枝生长的菌丝状态基本一致。相对于野生型核盘菌的菌丝生长状态,沉默转化子的菌丝出现弯曲生长的形态。根据以上结构,说明SsAms2在调控菌丝生长,菌丝分枝及形态中起到重要作用3.5沉默转化子的侵染垫形成观察将活化好的沉默转化子及野生型核盘菌打取菌饼,菌丝面向下直接接种于灭菌处理的载玻片上,置于湿润,25℃条件下孵育,孵育过程中加水保持湿润。核盘菌菌丝在玻璃上生长时会形成大量的侵染垫。待生长4-6d后,此时野生型核盘菌菌饼周围生长出大量侵染垫,观察比较沉默转化子侵染垫形成数量与野生型核盘菌的差别,见图3.5。37 第三章转录因子SsAMS2的功能验证WTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17图3.5沉默转化子及野生型核盘菌侵染垫形成Fig.3.5Infectcushionoftransformantsandwildtype核盘菌生长于玻璃表面时,会迅速产生侵染垫,当野生型核盘菌菌饼周围产生大量黑色侵染垫时,沉默转化子周围已有菌丝生长,但未产生大量的侵染垫。通过显微观察,沉默转化子的菌丝尖端有形成分枝聚集,弯曲成钩状的分化趋势,但未形成成熟的侵染垫,沉默转化子与野生型核盘菌在侵染垫产生上有显著差异,根据以上结果,SsAms2参与调控核盘菌侵染垫的形成。3.6沉默转化子的草酸产生溴酚蓝可以作为酸碱指示剂使用,当pH值大于4.6时溴酚蓝呈蓝色,当pH值低于3.0时溴酚蓝呈黄色,配制含浓度为100μg/mL溴酚蓝的PDA培养基。将沉默转化子及野生型核盘菌打取菌饼接种于直径9cm溴酚蓝PDA培养平板以及直径1.6cm的24孔培养板,分别生长2d和1d后,观察转化子及野生型培养基颜色变化,见图3.6。将转化子和野生型核盘菌的菌饼接种于YPSu液体培养基中,使菌饼浮于液体培养基表面,并在表面生长,置于25℃条件下培养3天后,使用精密pH试纸测定YPSu液体培养基的pH值,野生型核盘菌使用精密pH试纸范围为2.7-4.7,沉默转化子使用精密pH试纸范围为3.8-5.4,实验结果见图3.7。38 第三章转录因子SsAMS2的功能验证WTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17图3.6沉默转化子及野生型核盘菌PDA培养基酸碱性测定Fig.3.6PDAmediumacidityoftransformantsandwildtypeWTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17图3.7沉默转化子及野生型核盘菌YPSu培养基酸碱性测定Fig.3.7YPSumediumacidityoftransformantsandwildtype根据图3.6,当野生型核盘菌菌丝生长至基本覆盖培养基表面时,带有溴酚蓝的PDA培养基完全变为黄色,其pH值低于3.0,表明野生型核盘菌在菌丝生长过程中分泌产生大量的酸性物质,而草酸是核盘菌分泌的主要酸性物质。同一时期沉默转化子的菌丝已有生长,但其菌丝覆盖区域基本仍保持紫色,其PDA培养基的pH值大于4.6,表明沉默转化子的草酸等酸性物质产生量相对大量降低。根据图3.7,pH值为6.5的液体YPSu培养基在培养野生型核盘菌3天后,使用精密pH试纸测量,pH值变为2.7,而转化子SsAms2-93的pH值为5.1,SsAms2-98和SsAms2-17的pH值为5.4,表明野生型核盘菌分泌产生了大量草酸使培养基呈酸性,而沉默转化子仅产生少量酸性物质,与溴酚蓝颜色变39 第三章转录因子SsAMS2的功能验证化实验结果一致,同时pH值结果也表明草酸分泌的减少量与转化子中基因的沉默下调水平基本一致。根据以上结果,SsAms2参与调控核盘菌草酸等酸性物质的产生。草酸是核盘菌等植物病原真菌的重要致病因子,SsAms2基因表达水平下调后,草酸产生量的减少可能会导致核盘菌致病性的降低。3.7沉默转化子致病力测定选取生长7周,健康无病斑且生长状态一致的菜豆叶片,将沉默转化子以及野生型核盘菌打取菌饼分别接种于无创伤以及创伤处理的叶片上,在25℃,高湿度环境下进行离体叶片侵染实验,期间喷洒无菌水保持叶片湿润。接种2d后,观察叶片发病情况并统计叶片的病斑面积,见图3.8。AB叶叶正正叶叶背背WTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17WTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17CD未创伤创伤图3.8沉默转化子及野生型核盘菌侵染菜豆叶片发病情况及病斑面积。A:接种40 第三章转录因子SsAMS2的功能验证未创伤叶片发病情况,B:接种创伤叶片发病情况,C:接种未创伤叶片病斑面积,D:接种创伤叶片病斑面积。Fig.3.8Pathogenicitydetectionandlesionareaofinfectedcommonbeanleavesbytransformantsandwildtype.A:Pathogenicitydetectionofunwoundedcommonbeanleaves,B:Pathogenicitydetectionofwoundedcommonbeanleaves,C:Lesionareaofunwoundedcommonbeanleaves,D:Lesionareaofwoundedcommonbeanleaves.侵染菜豆叶片两天后,接种野生型核盘菌的无创伤/创伤叶片以菌块为中心均出现大面积褐色病斑,接种沉默转化子的无创伤叶片上仅在菌饼下出现小面积失绿,而接种转化子的创伤叶片上出现较大面积的病斑,但病斑面积仍显著小于接种野生型核盘菌的叶片病斑。相对于野生型核盘菌,沉默转化子的致病性显著降低,说明SsAms2参与调控核盘菌的致病性。结合前述研究,SsAms2的表达被沉默后,侵染垫的形成显著减少,侵染垫是核盘菌的重要侵染结构,对核盘菌侵入寄主过程有决定性作用,与在创伤叶片上能够引起较大面积的病斑的结果一致,同时草酸的形成量也大幅降低,而草酸能够破坏植物细胞,抑制寄主抗性,是核盘菌重要的致病因子,侵染垫和草酸的产生量减少是核盘菌致病性下降的重要原因。3.8沉默转化子抗活性氧及高盐测定核盘菌在自然生长过程中要面对不同的非生物胁迫的影响,对外界的各种胁迫耐受性会对其生长发育过程产生影响,环境中的高浓度活性氧能够破坏细胞的完整性,高盐环境也会改变细胞的通透性抑制真菌的生长,因而对沉默转化子进行抗活性氧及高盐耐受性生长测定实验。配制含过氧化氢浓度为5mM,15mM,25mM,35mM浓度的PDA平板,将沉默转化子及野生型核盘菌打取菌饼接种至不同浓度梯度的过氧化氢PDA平板中,在25℃条件下生长2周后,观察沉默转化子以及野生型核盘菌菌落生长大小。配制NaCl,KCl浓度为1M的PDA平板,将沉默转化子及野生型核盘菌接种至高盐PDA培养基中,置于25℃恒温培养3天后,观察沉默转化子与野生型核盘菌在菌落生长方面的差异,41 第三章转录因子SsAMS2的功能验证实验结果见图3.9。图3.9沉默转化子及野生型核盘菌过氧化氢及高渗透耐性测定Fig.3.9Oxditativeandhighosmoticassayoftransformantsandwildtype.在不同浓度梯度的过氧化氢平板上培养沉默转化子及野生型核盘菌,生长两周后,接种于25mM的过氧化氢PDA培养基上的野生型核盘菌未出现菌丝生长,在15mM过氧化氢的培养基中生长至两周后菌丝能够生长铺满培养基表面,但未有菌核产生,根据本实验,野生型核盘菌对过氧化氢最高耐受浓度为15mM。沉默转化子在25mM和35mM的过氧化氢培养基中仍然可以生长,但菌落生长明显受到抑制。真菌能够分泌过氧化物酶,分解环境中的过氧化物,抵抗外界逆境环境,但沉默转化子对过氧化氢的耐受性未降低,反而有增强趋势,表明SsAms2参与调控过氧化氢耐受性,且在过氧化物酶的分泌过程中可能存在负调控作用。将沉默转化子和野生型核盘菌分别接种于1M的NaCl,KCl培养基上,其野生型生长受到显著抑制,同时沉默转化子能够生长但也受到显著抑制。相对于野生型,高盐环境对沉默转化子的生长的抑制效果未出现显著差异,表明SsAms2的表达量下降对抵抗高渗透逆境胁迫生长无影响。3.9沉默转化子细胞核数量测定SsAms2能够调控菌丝的生长,菌丝的生长速度与细胞核的分裂相关,核盘42 第三章转录因子SsAMS2的功能验证菌菌丝细胞内有多个细胞核,SsAms2基因的表达量下降可能导致细胞内细胞核数量的下降。使用DAPI对沉默转化子及野生型核盘菌生长状态下的菌丝以及原生质体萌发出的菌丝进行染色,置于黑暗条件下染色30分钟后置于荧光显微镜下,在50倍物镜下可以清晰地观察到细胞核,在白光条件下观察菌丝形态,并对菌丝细胞中的细胞核数量进行统计,结果如图3.10。AWTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17B43 第三章转录因子SsAMS2的功能验证CWTSsAms2-93SsAms2-98SsAms2-17D图3.10沉默转化子及野生型核盘菌菌丝细胞核观察Fig.3.10Cellnucleusobservationinhyphaeoftransformantsandwildtype.根据荧光显微镜下细胞核染色观察,野生型核盘菌菌丝中的细胞核密集,44 第三章转录因子SsAMS2的功能验证且数量较多,相对于野生型沉默转化子中的细胞核分散,且在数量上显著少于野生型核盘菌,说明SsAms2能够调控细胞核的分裂。SsAMS2与裂殖酵母中的Ams2同源,Ams2在裂殖酵母中调控组蛋白基因的转录起始,从而调控组蛋白的行为,影响细胞分裂。据此实验,可以推测在核盘菌中的SsAMS2可能同样能够转录激活组蛋白基因,通过调控组蛋白基因的转录起始调控菌丝中细胞核分裂,从而影响菌丝的生长发育。3.10沉默转化子组蛋白基因及细胞分裂相关基因表达量分析组蛋白是染色体的基本结构,主要包括H2A,H2B,H3,H4,此外还有一些组蛋白变异体。组蛋白的合成会影响细胞分裂,从而影响生长,上述实验已证明SsAms2被沉默表达后,细胞核数量减少,细胞核分裂受到影响,为了研究细胞核数量的减少是否因为组蛋白的合成受到影响,选取组蛋白H2A(SS1G_10959),H2B(SS1G_10960),H3(SS1G_09608),H4(SS1G_09609)基因在沉默转化子中进行表达量分析,此外,根据生物信息学预测,SsAMS2与组蛋白H3变异体CENP-A以及细胞分裂相关蛋白Cdc6,Cdc28之间存在相互作用(图3.11),CENP-A在细胞分裂中着丝粒的形成具有重要作用,Cdc6,Cdc28是细胞周期信号通路中的关键蛋白。通过qRT-PCR检测沉默转化子中CENP-A基因cnp1(SS1G_00304)和cdc6(SS1G_04516),cdc28(SS1G_02296)基因的表达量,分析SsAms2是否参与细胞周期信号通路。对以上基因进行qRT-PCR实验,结果如图3.12。45 第三章转录因子SsAMS2的功能验证图3.11SsAMS2互作蛋白预测Fig.3.11InteractingproteinsPredictionofSsAMS2图3.12沉默转化子及野生型核盘菌组蛋白基因及细胞分裂相关基因表达量分析Fig.3.12Expressionlevelofthegenesrelevanttocellcycleandhistonegenesintransformantsandwildtype46 第三章转录因子SsAMS2的功能验证根据qRT-PCR实验结果,组蛋白H2A,H2B,H3,H4基因以及组蛋白H3变异体基因cnp1在沉默转化子中的表达量显著低于野生型核盘菌,SsAms2被沉默后,组蛋白基因的表达量显著下降,据此实验结果可以推断,SsAMS2能够调控组蛋白基因的转录,在细胞周期中的组蛋白合成中起到重要作用。细胞周期相关蛋白Cdc6,Cdc28在细胞分裂的S期起到重要作用,S期为细胞分裂间期,在此阶段DNA复制,同时也是组蛋白合成,并且与DNA结合成为核小体的时期,将SsAms2基因进行沉默后,Cdc6,Cdc28基因的表达量出现下调趋势,说明SsAMS2被沉默后,影响了细胞分裂S期信号通路相关基因的表达。根据以上结论分析,SsAMS2可能与其他转录因子Cdc6,Cdc28之间存在相互作用,共同参与调控S期组蛋白的合成。4小结将GATA转录因子编码基因SsAms2使用RNAi的方法进行沉默得到沉默转化子菌株。对沉默转化子的表型进行观察分析,基因SsAms2被沉默后相对于野生型核盘菌,菌丝生长速度显著变慢,生成菌核总重量及数量减少,同时菌丝形态出现弯曲,菌丝出现不正常分枝,沉默转化子的菌丝出现直角分枝并且分枝菌丝生长短小,通过对细胞核染色荧光显微观察,SsAms2被沉默后菌丝细胞中的细胞核数量减少,通过对组蛋白H2A,H2B,H3,H4基因及着丝粒形成相关的组蛋白H3变异体CENP-A基因cnp1以及调控细胞周期相关基因Cdc6,Cdc28的表达量分析,SsAMS2能够调控组蛋白基因的转录,并且可能与Cdc6,Cdc28相互作用共同调控组蛋白的合成,影响细胞核的分裂过程,从而调控核盘菌的生长发育过程;在抗活性氧实验中,SsAms2被沉默后菌落生长相对于野生型并未受到抑制,反而有抗性增强的趋势,根据此实验结果,推测SsAms2在平衡过氧化物酶的产生过程中起重要调控作用,并且对过氧化物酶的产生有负调控作用,在抗高渗透性环境的实验中,高盐环境对野生型及沉默转化子的抑制效果无显著差异,说明SsAms2不参与调控高渗透抗性;在致病性方面,沉默转化子的侵染垫的形成显著减少,侵染垫在核盘菌侵染寄主过程中起决定性作用,此外基因SsAms2被沉默后草酸的产生量显著减少,而草酸是47 第三章转录因子SsAMS2的功能验证核盘菌致病过程中的重要因子。通过离体菜豆叶片接种实验,接种沉默转化子的离体叶片的发病速度相对于接种野生型核盘菌的叶片的发病速度显著降低,沉默转化子侵染创伤叶片的病斑面积相对侵染未创伤叶片的病斑面积较大,说明SsAms2能够调控侵染垫的形成以及草酸的分泌,从而调控核盘菌的致病性。根据以上结果,SsAms2能够调控组蛋白基因的转录,影响细胞核的分裂过程,从而调控核盘菌的生长过程,对菌丝生长发育,菌核形成,侵染垫和草酸的产生具有调控作用,并且参与调控致病性的产生。48 结论结论GATA类锌指结构转录因子在真菌中已有广泛研究,在调控有性和无性发育,以及致病性方面都起到重要作用。在裂殖酵母中存在一个GATA类的转录因子Ams2,Ams2能够结合到组蛋白基因的启动子区域,启动组蛋白基因的转录,并且调控组蛋白H3的变异体SpCENP-A定位于着丝点,在染色体分离中起重要重要作用,Ams2的缺失和过表达都会导致细胞中组蛋白含量的紊乱,导致细胞分裂时的染色体不能正常分离和基因组的不稳定,从而影响酵母的正常生长。通过生物信息学分析及同源性比对,核盘菌中的SsAms2与裂殖酵母中的Ams2同源,据此推断SsAms2在核盘菌的细胞分裂中能够调控组蛋白的转录起始,并对着丝粒的形成以及染色体的分离具有调控作用,进而影响核盘菌的生长发育过程,因而对核盘菌SsAms2基因的功能进行研究。检索SsAms2基因序列,根据得到的基因序列设计两个相互独立的靶序列,将两个靶序列分别连接至RNAi载体pSilent-Dual1,使用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,将重组质粒分别转入核盘菌原生质体中,使用遗传霉素抗性筛选获得沉默转化子,并通过PCR检测和SsAms2基因相对表达量检测进行验证,在转化子中的SsAms2基因相对表达量出现显著的下降,表明SsAms2基因表达被沉默,对两个靶序列进行RNAi得到的转化子表型相同,说明RNA沉默未出现脱靶。通过观察分析,沉默转化子与野生型核盘菌的表型存在以下差异:第一,在核盘菌的生长发育方面,相对于野生型核盘菌,沉默转化子的菌丝生长速率变慢,形成菌核总重量降低,对菌丝形态进行显微观察,沉默转化子的菌丝出现弯曲,并且菌丝上出现不正常分枝,沉默转化子的菌丝出现直角分枝并且分枝菌丝生长短小。对菌丝进行DAPI染色并显微观察,沉默转化子的菌丝中细胞核数量减少,通过对组蛋白H2A,H2B,H3,H4及着丝粒形成相关的组蛋白H3变异体CENP-A基因的表达量分析,组蛋白相关基因均出现下调,对细胞周期调控蛋白Cdc6,Cdc28进行相关表达量进行分析,其表达量也出现下调,表明SsAMS2的表达量下调会影响细胞周期S期信号通路,而组蛋白的合成时期为S期,以上结论说明SsAMS2能够调控S期组蛋白基因的转49 结论录,并参与细胞周期信号通路,影响细胞核的分裂过程,从而调控核盘菌的生长过程;第二,在抗逆性方面,抗活性氧实验中SsAms2被沉默后菌落生长相对于野生型并未受到抑制,反而有抗性增强的趋势,根据此实验结果,推测SsAms2在平衡过氧化物酶的产生过程中期重要调控作用,并且对过氧化物酶的产生有负调控作用,在抗高渗透性环境的实验中,高盐环境对野生型及沉默转化子的抑制效果无显著差异,SsAms2不参与调控高渗透抗性;第三,在致病性方面,沉默转化子的侵染垫的形成显著减少,侵染垫在核盘菌侵染寄主过程中起决定性作用,在创伤叶片上接种沉默转化子后形成的病斑面积相对于沉默转化子侵染未创伤的叶片形成的病斑面积较大,说明沉默转化子的致病力下降与侵染垫的形成减少相关。在未创伤和创伤叶片上接种沉默转化子形成的病斑面积相对于野生型核盘菌均较小,说明除了侵染垫外还有其他因素影响了沉默转化子的致病性,草酸是核盘菌致病过程中的重要因子,基因SsAms2被沉默后草酸的产生量也显著减少,说明草酸合成减少也是导致核盘菌致病性下降的重要因素。因此,SsAms2调控侵染垫的形成以及草酸的分泌,从而调控核盘菌的致病性。综上,SsAms2能够调控组蛋白基因的转录,影响细胞核的分裂过程,从而调控核盘菌的生长过程,对菌丝生长发育,菌核形成,侵染垫和草酸的产生具有调控作用,并且参与调控致病性的产生,对过氧化物酶的产生具有负调控作用。关于基因SsAms2在核盘菌生长发育中的功能,在下一步工作中需结合蛋白水平的实验进行进一步研究,挖掘SsAms2相关的信号通路。本研究对基因SsAms2的功能进行了初步研究,为后续深入研究奠定了基础,为探索核盘菌防治新思路提供了理论支持。50 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致谢致谢三年的硕士研究生生活即将结束,回首过去的三年,学习了很多,也成长了很多,在论文完成,即将毕业之际,要向帮助过我的人致以感谢。首先要感谢我的导师潘洪玉教授,实验的设计和实施,以及论文的撰写和修改,都凝聚着老师的心血。潘老师严谨的治学作风、渊博的知识以及宽厚的胸怀为我树立了典范,在潜移默化中影响着我的科研态度以及言行,也将在未来的工作中使我受益。同时,潘老师也为我们创造了优越的实验条件,提供了充足的支持,这些都是我们科研过程中的强大后盾。同时也要感谢刘金亮老师、王岩老师、张艳华老师和张祥辉老师在研究生生涯中为我提供的帮助,关心以及在实验和论文完成过程中的指导,也感谢各位老师在实验室的管理上的付出,让803成为一个互帮互助,团结协作的大家庭。特别感谢刘玲师姐带我从分子生物学实验的入门到实验的一步步完成,从最开始入门时耐心细致的指导,到实验中问题的克服,每一步的成长都离不开刘玲师姐细致耐心的帮助。也感谢所有实验室的师兄师姐,师弟师妹们在研究生期间给予过我的帮助以及支持。最后,感谢父母的养育之恩,以及在研究生期间的理解与支持。65

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