崂山奶山羊乳腺上皮细胞转染褪黑素合成酶基因的研究

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1、分类号Ｓ８１４．８学号Ｓ２０似６１８四川巧化大学专业硕女学位论文＊＾峽山奶山羊乳腺上皮细胞转染繩黑素合成酶基因的研究宋憤乐巧导巧师周光巧巧巧刘国巧巧巧（中国农业大学）校外导师崔绪代勘研究贵（春曲巧巧变业有巧公哥）学位类别农业推广硕击．，＊，、＂ｉ？，’＂一－，—－■Ｘ－一、／、领巧名称养殖领城：＞二：：－－＇＇－＇－，一－；，一一—＾，研究方向动巧策殖乌化始工程￡：可？＊一－一心一，—一？一．＿广，？．‘■－一？‘．．ｆ一一．心辭

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3、ｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ（ｇｐｇｙ）Ｄ＾ｅｃ化ｄｉｉｂｙＰｒｏｆ－．ＺｈｏｕＧｕａｎｇｂｉｎ，Ｐｒｏｆ－．ＬｉｕＧｕｏｓｈｉＡｎｄＡｓｓｏｃ－ｉａｔｅＰｒｏｆ．ＣｕｉＸｕｄａｉＣｏｌｌｅｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｇｙＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＣｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ化ｎｅ，２０１５‘，本研究由国家科技重大专项强化權黑素功能现的转基因奶山羊新品种培育２０１４ＺＸ０８００８０２（巧资助

4、ＴｈｉｓｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｏｒｇａｎｉｓｍｓｂｒｅｅｄｉｎｍａｏｒｒｏｅｃｔｓｇｊｐｊＧｒａｎｔＮｏ．２０１４ＺＸ０８００８０２Ｂ（）论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机一构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的

5、任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名．Ｊ；诊長必年＾月日索／关于论文使用授巧的声明、；本人完全了解四川农业大学有关保留使巧学位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部ｎ或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。曰系论文不保密。□本论文保密，在年解密后运用本授权。＿□内划＂＂（请在Ｗ上Ｖ）研究生签名；扣ｋ年月日加ｆ＾／巧导师签名：ｗ／ｒ年知１节來炎去

6、摘要權黑素（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＴ）是嘲踩神经内分泌激素，具有调节生物钟、直接清除体内自由基、抗氧化和调节免疫功能等功效。通过乳腺反应器来生产罐黑素具有研究。意义和商业前景峡山奶山羊是我国特有的山羊品种，具有优良的产奶性能，是乳腺反应器的良好模型。本研究针对槐黑素关键合成酶乂和片／ＯＭＴ基因乳腺特异性表达载体转染山羊乳腺上皮细胞的操作进行了系统的研究。本研究通过活体采集峨山奶山羊的乳腺组织，利用组织块培养法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞，纯化后分别转染乂乂Ｔ和月７０ＭＴ基因，检测送两个外源基因在细胞中的表达水平和合成姆黑素的水平

7、，Ｗ验证是否可Ｗ作为转基因的供体细胞。（１）采取绵羊松果体细胞中克隆出乂４７似ｉｒ和片／ＯＭＴ基因，使用ＸｈｏＩ酶切并ＢＣ－－－－连接，构建载体ｐｌ乂和ｐＢＣｌＷＯＭＴ。再由质粒ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃｈｉｓ中扩增纯化得到上下游均添加了ＮｏｔＩ酶切位点的Ｎｅｏ片段，通过对Ｎｅｏ扩増片段及质粒ＢＣ－－ｌ乂Ｗ乂ｒ／ＢＣｌ祝ＯＭＴ进行ＮｏｔＩ单酶切后，连接片段构建能够在真核细胞进行ｐｐ－－－乂４ｉＶ－ＢＣｌ：４ｒＮｅｏ／ＢＣｌ／／／０ＭｒＮｅｏ。ＰＣＲ和抗性筛选的重组质粒ｐｐ茵液酶切验证，。结果表明呈阳性，检测序列正确（２）采集泌乳

8、期健康峨山奶山羊乳腺组织，进行组织块贴