奶山羊乳腺上皮细胞及耳尖成纤维细胞转人凝血因子ⅸ基因的研究

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1、分类号——UDC论文题目密级——编号——奶山羊乳腺上皮细胞及耳尖成纤维细胞转人凝血因子Ⅸ基因的研究EXPRESSIONOFHUMANCOAGULATIONF'ACTORIXGENEINGOATNn，蝴MARYEPITHELIALCELLSANDFIBROBLASTCELLSUSINGTARGETINGVETOR生盟业血盅型曲五一班擅童班堂原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得囱墓直太堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料

2、。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：蚴垒指导教师签名：趑日期：望!丝：!，在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意：若用于发表论文

3、，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。⋯一虢磕觯⋯～描日期：砼I出皇丛日期：塑!丝!￡：圣r目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3第一章实验研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．1．乳腺特异表达hFIX基因打靶载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1．1．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一51．1．2．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．1．2．1．从质粒pbCSN2-hFIx—pA_Rc中扩增人凝血因子]XcDNA序列⋯⋯⋯．51．1．2．2．扩增bGHPolyA序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～61．1．2．3．奶山羊B一酪蛋白基因5’同源臂的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．1．2．4．奶山羊B～酪蛋白基因3’同源臂的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．1．2．5．PCR扩增产物的连接、鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．1．3．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．1．3．1．1．人凝血因子IX的PCR扩增⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．1．3．1．2．bGHPoIyA的PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．1．3．1．3．奶山羊13一酪蛋白基因5’同源臂的PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯．101．1．3．1．4．奶山羊B一酪蛋白基因3’同源臂的PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯．101．1．3．1．5．hFIX插入表达载体PIlI-PGK—bGHPofyA-Neo‘⋯⋯⋯⋯111．1．3．1．6．5’同源臂的酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．1．3．1。7．3’同源臂的酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一121．1．4．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．2．奶山羊乳腺上皮细胞及奶山羊耳尖成纤维细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．2．1．奶山羊乳腺上皮细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．2．1．1．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．2．1．2．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．2．1．2．1．奶山羊乳腺上皮细胞的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．2．T．3．实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．2．1，3．1．奶山羊乳腺上皮细胞的形态观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、⋯⋯⋯⋯⋯191．2．1．3．2．奶山羊乳腺上皮细胞复苏后的形态观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．2．1．3．3．奶山羊乳腺上皮细胞生长曲线的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．2．1．3．4．免疫荧光细胞染色法鉴定奶山羊乳腺上皮细胞⋯⋯⋯⋯⋯211．2．1．3．5．RT-PCR检测13一酪蛋白mRNA水平的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．231．2．1．3．6．奶山羊乳腺上皮细胞对G418的敏感性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．241．2．2．奶山羊耳尖成纤维细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯251．2．2．1．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．251．2

8、．2．2．实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯