清半夏“长于燥湿化痰”的炮制机理研究

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1、ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine（药学院）二0一八届博士研究生学位论文清半夏“长于燥湿化痰”的炮制机理研究Processingmechanismsof“goodateliminatingdampnessandphlegm”ofthePinelliaeRhizomaPraeparatumCumAlumine研究生姓名：刘玉杰指导教师：吴纯洁学科专业：中药制剂学二O一八年五月成都中医药大学2018届博士研究生毕业论文学位论文清半夏“长于燥湿化痰”的炮制机

2、理研究Processingmechanismsof“goodateliminatingdampnessandphlegm”ofthePinelliaeRhizomaPraeparatumCumAlumine刘玉杰指导教师姓名：吴纯洁申请学位级别：博士研究生专业名称：中药制剂学论文提交时间：2018.04论文答辩时间：2018.05二O一八年五月成都中医药大学2018届博士研究生毕业论文1摘要清半夏是半夏经白矾加工而来的炮制品，传统炮制理论和现代研究认为，其炮制主要目的是降低半夏的毒性和刺激性，并使其“长于燥

3、湿化痰”。半夏及清半夏在临床上被证明具有明显的化痰效果。然而，目前的文献报道采用的酚红气管排泌等药理实验未能合理评价和验证半夏及清半夏“燥湿化痰”的作用，亟待建立合理的“痰证”模型。半夏毒性及其炮制解毒的机理已初步阐明，但与其“燥湿化痰”功效相关的物质基础尚无定论，炮制机理尚不清楚。目的：通过建立大鼠过敏性哮喘模型和体外NCI-H292细胞模型（“痰证”模型），系统评价半夏及清半夏“燥湿化痰”的作用，并初步阐明其作用的机制；通过对半夏和清半夏化学成分的分析，明确炮制对半夏化学成分的影响；在此基础上，通过对清

4、半夏大、小分子类成分分离及活性评价，探索清半夏发挥功效的作用部位；通过基于“谱效”关系和相关性分析的清半夏小分子成分研究和基于多糖分离纯化及活性评价的清半夏大分子成分研究，阐明清半夏的功效相关的物质基础和炮制机理。方法：（1）半夏与清半夏“燥湿化痰”的作用及机制研究：建立大鼠过敏性哮喘（“痰证”）模型，通过对大鼠肺组织病理学检查、BALF中EOS细胞计数、IL-4和IFN-γ水平检测、血清IgE水平检测来评价生半夏与清半夏“燥湿化痰”的作用；通过肺组织中MUC5AC和AQP-5mRNA表达水平和蛋白表达水平

5、检测，探讨其“燥湿化痰”的作用机制；同时，以LPS建立体外NCI-H292细胞模型，以细胞MUC5AC蛋白、IL-4、IFN-γ因子水平为指标，进一步评价生半夏与清半夏“燥湿化痰”的作用。（2）半夏炮制前后的化学成分分析：通过HPLC-ESI-LTQ-OrbitrapMS/MS技术分析半夏炮制前后的化学成分，明确炮制对半夏“小分子”类化学成分的影响；对生半夏与清半夏中的大分子成分多糖进行研究，分析炮制前后多糖的含量、基团、表面形态、单糖组成、分子量分布等差异。（3）清半夏“长于燥湿化痰”作用的大、小分子部位

6、研究：通过1000Da的透析1[课题来源]国家自然科学基金：清半夏“长于燥湿化痰”的“大分子”物质及作用机制研究（No.81573610）I成都中医药大学2018届博士研究生毕业论文袋将清半夏水提液分为大、小分子两个部分；通过建立体外NCI-H292细胞模型，以细胞中MUC5AC蛋白和IL-4、IFN-γ因子水平为指标，评价大、小分子成分“燥湿化痰”的作用，初步确定清半夏发挥功效相关的作用部位（大分子还是小分子）。（4）清半夏“长于燥湿化痰”作用的“谱效”关系研究：收集20批清半夏样品，建立其水溶性成分的H

7、PLC指纹图谱；建立NCI-H292细胞模型，以细胞MUC5AC蛋白降低率为指标，建立清半夏指纹图谱与“燥湿化痰”作用之间的“谱效”关系；测定20批清半夏中白矾的含量，并分析其与MUC5AC蛋白降低率之间的关系；通过两者结合，初步确定清半夏“长于燥湿化痰”作用相关的小分子成分。（5）清半夏多糖的提取分离、结构鉴定及其“燥湿化痰”作用的研究：首先采用响应面（RSM）法优化清半夏多糖的提取工艺；按照优化后的工艺提取多糖，分别以DEAE-cellulose和葡聚糖凝胶分离纯化得到均一多糖成分，并分析其结构；通过建

8、立体外NCI-H292细胞模型，以细胞MUC5AC蛋白和IL-4、IFN-γ水平为指标，评价均一多糖“燥湿化痰”的作用，明确清半夏“长于燥湿化痰”作用相关的大分子成分。结果：（1）动物实验结果表明，生半夏和清半夏均能减轻过敏性哮喘模型大鼠肺组织炎性细胞浸润、黏液高分泌等病理学状态，降低大鼠BALF中EOS细胞和IL-4水平、升高IFN-γ水平，并降低血清IgE水平。生半夏和清半夏对大鼠过敏性哮喘均具有一定的治疗作