基于人尿源干细胞的骨组织工程研究

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1、上海交通大学博士学位论文基于人尿源干细胞的骨组织工程研究作者：关俊杰导师：张长青教授专业：外科学（骨科）申请学位：博士研究生研究方向：干细胞与骨组织工程院系：上海市第六人民医院学号：0127259328资助基金:上海市重中之重临床医学中心建设项目答辩日期：2015年4月23日上海交通大学2015年4月ADissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofPhilosophyDoctorResearchofbonetissueengineeringbasedon

2、humanurine-derivedstemcellsAuthor:JunjieGuanAdvisor:Prof.Chang-QingZhangInstitute:Shanghaisixthpeople’shospitalSpecialty:Surgery（orthopedics）SchoolofMedicineShanghaiJiaoTongUniversityShanghai,P.R.ChinaApr.2015上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中

3、已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015425年月日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密

4、□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。√（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日2015425日期：年月日2015425上海交通大学博士毕业论文基于人尿源干细胞的骨组织工程研究摘要目的：本实验从成人清洁中段尿中分离尿源干细胞（humanurine-derivedstemcells,USCs），并探究USCs的生物学特征，通过增殖速度、表面标志物和多向分化潜能比较USCs与脂肪来源的干细胞（adipose-derivedstemcells,ASCs）的生物学特征;在此基础上，探究骨形态发生蛋

5、白2（Bonemorphogeneticprotein2）转染对USCs成骨分化能力的影响；然后，研究USCs在磷酸三钙（β-TCP）上的生物学行为，最后，将USCs接种至β-TCP上并移植到大鼠股骨大段骨缺损中，探究USCs/β-TCP复合物对大段骨缺损的修复作用。方法：第一部分：收集健康成人清洁中段尿200ml，离心洗涤后加入配制的专用培养基来培养USCs。通过CCK-8和流式细胞仪检测USCs增殖能力和表面标志物。加入诱导分化培养基，探究USCs成骨、成软骨和成脂肪分化能力。第二部分：体外构建含人BMP2基因的慢病毒载体并转染

6、USCs，检测转染效率和转染后细胞活力，检测转染对USCs碱性磷酸酶活性（ALP），矿盐沉积和成骨标志物表达的影响，将转染BMP2的USCs移植到裸鼠体内分析其异位成骨能力。第三部分：分离并扩增USCs，将USCs接种至β-TCP支架上，通过扫描电镜，CCK-8和活死细胞染色检测USCs在β-TCP上的粘附、增殖和存活，成骨诱导培养基培养7天和14天后，通过ALP活性和成骨基因表达检测USCs在β-TCP上成骨分化情况。第四部分：将USCs/β-TCP复合物移植到大鼠6mm股骨缺损处，在术后4、8和12周通过X线，micro-CT以

7、及组织学染色来分析骨缺损的愈合情况。结果：第一部分：5-7d后在培养板中观察到细胞克隆出现，14d后可以达到90%的融合。CCK-8证实贴壁细胞增殖活跃，与ASCs一样呈现“S”形增殖曲线。流式细胞仪结果证实USCs和ASCs表达CD29，CD44，CD73，CD90，不表达CD31，CD34，CD45，CD133和HLA-DR。但CD105在ASCs中表达较高，而在USCs中表达较低。USCs可以向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。与ASCs具有同样的多向分化能力。经过体外多次传代后，USCs仍然显示正常的I上海交通大学博士毕业论

8、文核型。第二部分：流式结果显示慢病毒转染效率高达90%，且转染后细胞增殖未受明显的影响。慢病毒转染BMP2基因到USCs后，BMP2基因表达和蛋白分泌量明显增多，BMP2转染组ALP活性和矿盐沉积明显高于普通USCs和GFP转染组。同