人尿源性干细胞的分离培养及向神经细胞定向分化的体内外实验研究

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3、Ym㈣2；蕾m02㈣7㈣29㈣2研究背景及研究目的：中枢神经系统损伤的治疗一直是世界性难题，通过移植干细胞替代受损神经细胞继而重建神经功能的治疗方法越来越受到重视。研究表明移植神经干细胞(NeuralStemCells，NSCs)治疗中枢神经系统损伤均具有一定疗效，但是NSCs来源有限、分离和培养均相当困难，移植NSCs又存在医学伦理限制、免疫排斥和存活率低等问题。而间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)来源广泛、分离培养技术成熟、无伦理限制和低免疫原性，但MSCs的获取手

4、段多为有创的。人尿源性干细胞(humanurine．derivedstemcells，hUSCs)是从尿液中分离出的多能干细胞，来源不受局限且安全无创，具有广阔的临床应用前景。现阶段国内外对其研究甚少，目前研究证实hUSCs具有MSCs的类似特性：表达类似的膜表面标志物及具有分化为成骨细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞的潜能。然而目前尚未见hUSCs向神经细胞定向分化的相关报道，本实验旨在体外分离培养hUSCs，观察其生物学特性，并于体外和体内鉴定其向神经细胞分化的能力，为将来利用干细胞移植治疗中枢

5、神经系统损伤疾病寻找新的“种子细胞"来源。方法：1、建立体外分离培养hUSCs的技术并观察其生物学特性1．1利用LMMl01培养基贴壁筛选法分离培养hUSCs；1．2MTT法观察细胞增殖能力；1．3流式细胞术检测表面抗原CD29、CD90、CD44、CD45、CD34、CD73和CDl33等的表达情况；1．4采用成脂和成骨诱导培养基分别对hUSCs进行体外诱导，并采用油红O和茜素红染色进行鉴定；2、体外诱导hUSCs向神经细胞定向分化采用成神经诱导培养基对hUSCs进行神经定向诱导，实时定量荧光PCR

6、(q．PCR)检测Nestin、Sox2、GFAP、B．tubulinIll、NSE和MAP2mRNA的表II摘要达变化，细胞免疫荧光染色检测Nestin、Sox2的表达情况。3、体内移植GFP．hUSCs，观察hUSCs在大鼠脑内增殖分化情况利用水凝胶负载GFP．hUSCs移植到大鼠模型的脑损伤区，荧光显微镜下观察脑内GFP表达阳性细胞的分布情况，细胞免疫荧光染色检测Nestin、GFAP和B．tubulinIII的表达情况。结果：1、成功建立了从人新鲜尿液中分离培养hUSCs的技术hUSCs细胞于

7、接种后3．7d开始贴壁，7．10d细胞呈集落生长，lO．15d不同细胞克隆呈现4种不同形态：“铺路石’’上皮细胞样、长梭形肌细胞样、扁圆形内皮细胞样和短梭形成纤维细胞样，经过2．3周的传代培养后P4代细胞形态呈较为均一的成纤维细胞样，细胞传至P10余代，仍然保持旺盛的增殖能力。2、hUSCs的生物学特性2．1MTT法检测细胞增殖能力的结果显示hUSCs生长曲线呈S形。2．2流式细胞术检测结果显示分离得到的hUSCsCD44、CD29、CD90和CD73表达阳性，CD34、CDl33和CD45表达阴性，

8、表明其与间充质干细胞表达类似的细胞表面标志物。2．3体外采用成脂和成骨诱导培养基分别对hUSCs诱导14d和21d后，油红O和茜素红染色均为阳性，表明hUSCs体外具有成脂和成骨的分化潜能。3、体外诱导hUSCs向神经细胞定向分化q-PCR结果显示hUSCs经神经定向诱导培养7d后Nestin、Sox2、MAP2、NSE、GFAP表达分别上调8．08+0．95倍、3．75士0．88倍、5．12士0．46倍、2．08+0．11倍和5．603：1．86倍，诱