人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究

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1、人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究作者：农丕地，黄海玲，解继胜【摘要】　　目的拟建立一套较为简便、有效和实用的人脐血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系，探讨其向成骨细胞分化的可行性。方法由人脐静脉血获得MSCs，纯化培养后用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导，通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色检测诱导后细胞。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，间充质样细胞为类似成纤维细胞样的细胞形态。诱导培养的细胞碱性磷酸酶染色呈阳性。结论人脐血MSCs经合理的体外诱导培养后，可以分化为成骨细胞。【关

2、键词】胎血间质干细胞成骨细胞细胞分化地塞米松β-甘油磷酸钠　　Abstract:ObjectiveToestablishamoresimple,effectiveandpracticalisolationandculturesystemforhumanumbilicalcordblood(HUCB)-derivedmesenchymalstemcells(MSCs),andinvestigatethefeasibilityofturningthemintoosteoblasts.MethodsMSCsisolatedfromHUCBediumincludi

3、ngdexamethasone,vitaminCand?-glycerophosphate.Aninvertedmicroscope,immunocytochemicalstainingforalkalinephosphatase(ALP)ononuclearcells,esenchymal-likephenotype.TheMSCsininducedcultureshomunocytochemicalstainingforALP.ConclusionTheHUCB-derivedMSCscanbeculturedanddifferentiatedinto

4、osteoblastsinvitro.　　Keyesenchymalstemcells;osteoblasts;celldifferentiation;dexamethasone;?-glycerophosphate　　脐血(humanumbilicalcordblood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞。目前研究证实脐血中存在的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在一定条件下进行体外培养和诱导分化后能成为神经细胞(神经元和神经胶质细胞)、心肌细胞、软骨细胞［1～4］，可作为细

5、胞治疗新的种子细胞和基因治疗新的载体细胞。随着组织工程学研究的深入，对于相关功能细胞研究逐渐扩展到干细胞领域，MSCs对骨组织修复有重要意义，本实验主要探索人脐血MSCs分离培养及分析其向成骨细胞分化的可行性。　　1材料与方法　　1.1材料　　主要试剂和仪器：Dulbecco改良培养基(DMEM)，胎牛血清（HYCLONE公司）；β-甘油磷酸钠、地塞米松（美国SIGMA公司）；Percoll分离液(PHARMACIA公司)；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯；CO2培养箱（SHELDONA公司）；AE31型倒置显微镜（MOTI

6、C公司）。　　1.2方法　　1.2.1脐血MSCs的分离培养　　从胎盘脐静脉穿刺抽取15ml脐血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50ml离心管，先加入15ml密度1.077g/ml的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物（富含单个核细胞），800r/min离心洗涤2次，5min/次，沉积细胞用含15％胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1×109/L，接种于25T的培养瓶内，放置在37℃、体积分数为0.05的CO2饱和

7、湿度培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其他未贴壁细胞，以后视细胞生长情况平均三四天换液1次。　　1.2.2脐血MSCs的传代培养　　MSCs约于7周相互汇合达培养瓶底70％～80％的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2ml0.25％的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回、细胞间隙增大、细胞近乎圆形为度，加入含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，收集细胞，800r/min离心洗涤2次，每次5mi

8、n，接种于置有盖玻片的24孔培养板中。　　1.2.3MSCs诱导培