脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展论文

《脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

　　脐血间充质干细胞的培养及诱导分化的研究进展论文【关键词】脐带血;间充质干细胞;分化骨髓是间充质干细胞的丰富来源，但是关于脐血及循环血中是否存在MSC，在研究初期一直存在争议。2000年，Erices1等首次报导了从脐带血中分离培养出低密度类似骨髓MSCs的贴壁细胞，其表达SH1，SH2等间充质细胞标志抗原，并可分化成为成骨细胞和脂肪细胞，其免疫表形和功能特点与骨髓来源的MSC极为相似.freelalstemcells,MSCs)，并且具有多向分化潜能2和很高的可塑性。人脐血MSCs有干细胞的共性，即具有自我更新并多向分化的潜能。在不同诱导条件下，人脐血MSCs除具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞分化的能力外3还可跨胚层分化为外胚层的神经细胞和内胚层的肝细胞等4。由于MSCs的多向分化潜能、胚胎干细胞的特性、对造血作用的影响及典型的免疫调控作用，在体外易分离扩增，具有自我更新和多向分化的潜能，来源广泛，便于取材，对供者无不利影响，使其成为研究的新的热点之一。1MSCs的分离和培养脐血采集：选择健康足月产或早产妇，胎儿娩出后，在距胎儿57cm的脐带处进行结扎，剪断脐带，穿刺脐静脉，用含抗凝保护液的采血袋抽取50ml左右的脐血，4℃冰箱保存，4小时内处理标本。MSCs存在于人的多种组织，但普遍存在于成人的骨髓。1976年，Friedenstein等人根据骨髓来源的成纤维样细胞和造血干细胞系对培养皿底部的粘附性的差异，首次从兔骨髓中成功分离了MSCs5。此方法到目前为止被认为是一种有效的分离骨髓的方法，但是用这种方法分离的MSCs中含脂肪细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞和部分的血细胞与造血干细胞6。 近年来，对MSCs的分离的方法主要有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞分离法和免疫磁珠法等。目前常用的方法是先用Ficoll或Percoll分离液进行密度梯度离心分离出脐血单个核细胞，再依据MSCs在体外培养中贴壁生长的特性，用贴壁筛选法，将其与非贴壁细胞分离。此法虽然分离所得细胞纯度不高，但简单易行，对细胞的损伤小，能较好地保持细胞活性。流式细胞分离法是根据MSCs体积大小及细胞表面的一些特殊标志，采用流式细胞仪对其进行分选。免疫磁珠法是使用表面附有特异性抗体的磁珠与MSCs结合，再用永久磁铁吸引出MSCs。后两种方法可分离出纯度较高的MSCs,但分离过程对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失活，而且对实验条件要求较高，费用昂贵，所需样本量大，所以并未得到广泛应用7。也有学者采用单细胞克隆技术获取纯的干细胞株8。有些研究还发现脐血中的间充质干细胞的频率随妊娠时间的延长而逐渐下降，推测这种现象与发育过程中造血部位向骨髓的迁移有关。Karen等9发现，MSCs分离较为合适条件是，样本保存时间不超过15个小时，样本中血液体积要超过33mL，并且血液中要没有血凝块和胰酶，单份血液中的单个核细胞的数量要大于1×108。随着研究脐带血间充质干细胞的学者越来越多，结论也越来越趋于一致，脐血中的确存在着MSC，但脐血间充质细胞所占的比例远较骨髓低的多(0.052.8/1×106脐血单个核细胞，25/1×106骨髓单个核细胞),MSC连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，而且保持正常的核型和端粒酶活性。细胞周期研究表明，85%以上的MSC处于Gl/GO期，用流式细胞仪分析MSC的RNA和DNA含量发现，脐带血MSC有5%处于GO期，而骨髓MSC有20%处于GO期。在培养方面还没有统一的方法，培养的方案也各不相同。目前常用的培养基有MesencultTM、DMEM、IMEM及DMEM/F12培养基等。Romanov等10用含10%胎牛血清LGDMEM培养基培养出优质生长良好的间充质干细胞。Lee11用含20%胎牛血清，L谷氨酰胺的IMDM培养基，并加入碱性成纤维生长因子，也培养出生长良好的干细胞。但是由于胎牛血清在一些情况下促分化作用强于促增殖作用，因此近年来在以干细胞增殖为目的的培养中越来越多的采用低血清或无血清培养体系，以提高MSCs的增殖能力和分化潜能。研究还发现不同的接种密度、不同的pH值、不同的首次换液时间都会影响mscs的生长。2脐血间充质干细胞的形态和表面标记体外培养的脐血MCS形态与骨髓MSC相似，呈梭形或纺锤形，原代培养的脐血，在接种4～7d后出现贴壁的间充质样细胞，开始为圆形或不规则形，逐渐伸出突起，最初散在分布，与大量的破骨样细胞混杂存在。破骨样细胞胞体较大、多核，MSCs多为成纤维样的长梭形细胞，少部分呈多角形，单个核，有较长的突起，折光性强。随着不断传代可以逐渐去除破骨样细胞，剩下形态较为单一的成纤维样细胞，即为脐血源性的MSCs。 目前认为MSC表面抗原无特异性，既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征，因此MSCs被认为是一个异质细胞群12。根据现有报导，迟作华等13总结了脐血MSC表达的主要分子，包括：(1)黏附附分子，CD54,CD51,CD44,CD13等;(2)整合素家族成员，CD49b,CD49e,CD29等;(3)其他，CD90(Thyl),SH2(CD105),HLAABC,ASMA,SH3(CD166,.freelol/L的5氮杂胞嘧啶核苷诱导3周后体积延长，与邻近细胞形成连接，并表达肌节性肌动蛋白和结蛋白，向肌源性定向分化。向肝细胞分化：Hong等16由脐血中分离出MSCs后，在其培养基中加入HGF和OSM后，通过流式细胞仪、RTPCR、SCs传代分化成为神经样细胞。荧光激活细胞分选术(FACS)显示：MSCs不表达CD34、CD11a和CD11b类抗原，但表达CD29和CD71，它的表达模式和BMMSCs完全相同。4脐血MSC对造血的支持作用MSCs是造血微环境的重要组成部分，能营养造血干细胞，凋节造血干细胞的定位、自我更新和分化。MSCs的调节功能主要通过其分泌的细胞因子和生长因子进行，这包括自细胞介素类、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、基质源性因子1(SDF1)、SCF、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维生长因子2(FGF2)、巨噬集落形成因子、血小板生成素(TPO)、肿瘤凋亡因子B(INFB)等19。在成人骨髓中，MSC通过细胞间的相互作用以及分泌造血生长因子和细胞因子，为造血干细胞的分化和增殖提供信号，有研究提示脐血MSC同样具有此功能，可分泌多种造血生长因子如SCF、IL6、TNFα，与CD34+造血细胞共培养，经14d的共培养，CD34+的细胞量高出4倍左右20。MSC对造血系统的作用还在于它能被诱导分化成骨髓微环境的各种组成成分，如骨、脂肪和基质组织等。5问题及展望 培养成功率低，是否能培养出MSC存在争议。较一致的意见是是孕早、中期较易培养出MSC，估计一方面胎儿存在着造血部位的逐渐转移过程,MSC作为支持造血的基质细胞，随其转移，从早期的造血器官逐渐向骨髓转移，所以在孕期结束时，这种转移也渐趋完成，因此脐带血及成人外周血中的MSC含量极低，给培养造成极大困难，另外不同个体之间存在着生物学差异，实验条件也不同，所应用的分离方法、培养基及血清等都存在着差异，出现不同的实验结论可以解释。目前存在的问题是如何找出影响成功的因素、提高产率和成功率，可能最佳的解决方法是充分认识MSC的特征，找到更特异的标志。与骨髓来源MSC的异同。脐血MSC呈梭形成纤维样细胞形态，较骨髓来源的MSC体积稍小，都不表达造血细胞的樗，表达一些黏附分子、整合素家族的分子及其他与骨髓来源的MSC相似，不同的是不表达CD90，而骨髓强表达CD90，成骨细胞祖细胞的标志CD166表达远低于骨髓MSC。脐血MSC的优势与不足。脐血间充质干细胞存在的致命问题是频度低，培养相对较困难，这是与骨髓相比无法克服的不足，但也有着它自己的优势:(1)来源丰富、易于采集保存，对产妇及新生儿均不造成伤害，不涉及伦理问题;(2)免疫源性相对较低;(3)由于有胎盘的屏障作用，疾病传染的几率下降;(4)含有的干细胞种类丰富，而且可能是更早期的干细胞。脐血间充质干细胞可以从冷冻保存长达0.55年的脐血中培养成功，这意味着脐血MSC有着其他来源的MSC所不具备的优势，但应该考虑如何改进培养方法，优化条件提高培养成功率，才可以提供足够的细胞数量。脐血MSCs作为一种新的神经干细胞来源，具有取材容易、来源丰富、免疫源性较弱等优点，在细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程学中具有重要的研究和应用价值，日渐受到国内外学者的关注。但目前对脐血MSCs的研究尚处于初级阶段，仍存在许多尚待解决的间题，如:目前为止还没找到具有临床价值的细胞类型的最佳有效扩增条件;缺乏可靠的鉴定MSCs的统一标准;脐血MSCs诱导分化为神经细胞的分子机制尚未明了;脐血MSCs诱导分化出的神经细胞是否具有完整的生物学功能还未证实等。这些问题都有待于进一步研究和探讨，目前有关脐血MSCs定向分化的生物学机制研究正在积极开展，相信不久的将来这些问题将逐渐阐明。总之，脐血MSCs移植为治疗神经损伤疾病提供了广阔的前景，脐血来源的干细胞有望成为组织工程中的种子细胞，将对神经系统的细胞治疗和基因治疗起到极大的推动作用。【