基于~1h nmr技术的奶牛ⅰ型和ⅱ型酮病血浆代谢组学分析

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1、摘要酮病是围产期高产奶牛常见而多发的一种能量代谢障碍性疾病。本病主要以低血糖、高酮体和高游离脂肪酸为生化特征；能量负平衡（Negativeenergybalancen,NEB）、脂肪过度动员为本病的病理学基础。通常根据血中酮体水平及临床症状，奶牛酮病被分为临床型酮病以及亚临床型酮病，有关它们的病因学研究已有很多。然而，借鉴于糖尿病的分类，根据血中酮体、葡萄糖以及游离脂肪酸的水平，奶牛酮病又被分为Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病。目前，关于奶牛Ⅱ型酮病的代谢组学研究报道极少。因此，本研究应用核磁共振技术并结合多元统计分析，对Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病的奶牛血浆进行全景式代谢变化的研究，旨在筛选出奶牛Ⅰ

2、型酮病和Ⅱ型酮病的差异性特征性代谢物，为丰富奶牛Ⅱ型酮病的病因学以及奶牛酮病防治新策略提供科学依据。本研究根据血浆中β-羟丁酸（BHBA）、葡萄糖（Glc）和游离脂肪酸（NEFA）的水平，选取了50头产后7-28天试验奶牛，其中无其他疾病的Ⅰ型酮病组奶牛（K1，n=20头）血浆中BHBA>1.20mmol/L，Glc<2.50mmol/L，NEFA>0.50mmol/L；Ⅱ型酮病组奶牛（K2，n=20头）血浆中BHBA>1.20mmol/L，Glc>2.80mmol/L,NEFA>0.50mmol/L；健康对照组奶牛（C，n=10头）血浆中BHBA<1.00mmol/L，Glc

3、>3.75mmol/L，NEFA<0.40mmol/L。11先运用核磁共振技术（HNuclearMagneticResonance，HNMR）对三组试验奶牛的血浆样品进行代谢物检测，而后进行主成分分析（PrincipleComponentAnalysis，PCA）、偏最小二乘方方法（PartialLeastSquares-discriminantAnalysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘方方法（OrthogonalPartialLeast-SquaresDiscriminantAnalysis，OPLS-DA）等多元统计分析，再应用生物学信息技术对差异性代谢物进行生物学分

4、析。最后采用酶联免疫（EnzymeLinkedImmunosorbentAssays，ELISA）方法对Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病筛选出的内源特征性差异代谢物进行验证。Ⅰ型酮病、Ⅱ型酮病与健康对照组奶牛三组间代谢成分存在显著差异。鉴定出26种差异代谢物，相对于健康对照，Ⅰ型酮病血浆中升高的2种物质为β-羟丁酸、丙酮；降低的15种代谢物为丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、柠檬酸、肌酸、甲酸、脂质、肌醇、O-乙酰葡萄糖胺、磷酸胆碱、α-葡萄糖、β-葡萄糖，有显著的差异(P<0.05)。相对于健康对照，Ⅱ型酮病血浆中升高的3种代谢物为β-羟丁酸、丙酮、乳酸；降低的4种代谢物为

5、丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、肌酸，有显著的差异(P<0.05)。与Ⅱ型酮病相比，IⅠ型酮病血浆中升高的8种代谢物为β-羟丁酸、乙酸、丙酮、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白；降低的14种代谢物为丙氨酸、柠檬酸、甲酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、脂质、赖氨酸、肌醇、O-乙酰葡萄糖胺、磷酸胆碱、α-葡萄糖、β-葡萄糖，有显著的差异(P<0.05)。将差异性代谢物通过KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）数据库分析，检测到的代谢物不仅参与糖代谢、脂肪代谢和氨基酸代谢等能量代谢，也参与酮体的形成。从这些差异性代谢物中筛选出

6、与奶牛Ⅰ型和Ⅱ型酮病代谢密切相关的11种差异性代谢物为丙酮酸、α-酮戊二酸、胆碱磷酸甘油酯、草酰乙酸、甘氨酸、酪氨酸、柠檬酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、乳酸，并用ELISA方法对这111种差异代谢物进行验证，其浓度变化结果与HNMR技术的检测结果相符。1应用代谢组学的HNMR技术筛选和确证了Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病的血浆差异代谢物，不仅验证了奶牛酮病发生过程中糖、脂类和氨基酸的代谢紊乱，也为今后进一步探究Ⅱ型酮病的发病机制和防治奠定理论基础。1关键词：Ⅱ型酮病；Ⅰ型酮病；代谢组学；HNMR；多元统计分析IIAbstractKetosisisanimportantenergymetab

7、olicdisorderthatcommonlyoccurinhigh-producingdairycowsduringtransitionperiod,isbiochemicallycharacteristicoflowbloodglucose,highketonebodyandhighfreefattyacid.Neg-ativeenergybalance(NEB)andexcessivefatmobilizationarethepathologicalfoundationforketo