咖啡酸3，4-二羟基—苯乙基酯诱导乳腺癌细胞凋亡的作用研究

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1、中文摘要咖啡酸3,4-二羟基-苯乙基酯诱导乳腺癌细胞凋亡的作用研究乳腺癌是常见的恶性肿瘤，严重威胁女性健康。在乳腺癌中，生长因子及其受体的异常激活起着关键的作用，如何抑制该途径发挥作用一直是研究的热点。植物药副作用小、对正常细胞几乎无毒性，所以人们一直试图从植物中提取出对抗生长因子作用的有效成分。咖啡酸3,4-二羟基-苯乙基酯（CADPE）是从植物长毛香科（Teucriumpilosum，又名铁马鞭）和草珊瑚中分离出来的抗肿瘤药物。由于CADPE毒副作用较少、安全性好，且具有广谱的抗肿瘤作用，近年受到广泛关注。但CADPE是否具有抗乳腺癌作用及其相

2、关的作用机制，仍缺乏相关报道。因此，本研究采用人乳腺癌细胞系，探讨了CADPE的抗乳腺癌作用及其相关机制，发现CADPE可以抑制乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡，并有望成为有效的生长因子拮抗剂。一、方法（一）乳腺癌细胞增殖人乳腺癌细胞系MCF-7、MCF-7ADR、MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞体外培养，同时添加CADPE处理细胞，采用单细胞增殖检测试剂盒检测乳腺癌细胞增殖情况。（二）乳腺癌细胞凋亡检测Hoechst33342染色法、流式细胞术AnnexinV-PE/7-AAD双染色检测CADPE作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和M

3、DA-MB-435细胞的形态学变化及凋亡率。（三）乳腺癌细胞线粒体凋亡途径相关测定采用不同浓度CADPE作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞，利用DCFH-DA（细胞活性氧检测探针）测定细胞内的活性氧变化，JC-1法测定线粒体膜电位改变，Westernblot检测caspase-3，Bcl-2和IBax蛋白表达。（四）生长因子受体及相关酪氨酸激酶磷酸化检测Westernblot方法检测CADPE对VEGF、EGF、PDGF、HGF刺激的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞VEGFR、EGFR、S

4、rc及C-Met磷酸化水平的影响。（五）Her-2、c-myc及maz蛋白表达分析Westernblot方法检测CADPE处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞后Her-2、c-myc及maz蛋白表达。（六）裸鼠体内荷瘤实验将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞接种裸鼠皮下，待成瘤后，每周两次腹腔注射2.5mg/kg的CAPDE，观察CADPE对肿瘤生长及裸鼠体重影响。二、结果（一）CADPE抑制乳腺癌细胞增殖采用CADPE处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和MCF-7ADR细胞，结果显

5、示CADPE10～80μmol/L的CADPE作用24h、48h和72h，均能明显抑制乳腺癌细胞增殖。（二）CADPE诱导乳腺癌细胞凋亡采用Hoechst33342染色乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞，荧光显微镜下观察CADPE处理后细胞形态变化，结果显示存在细胞核浓缩等细胞凋亡特征。AnnexinV-PE/7-AAD双染色结果显示20μmol/LCADPE作用48小时后细胞的凋亡率较对照组显著增高（p<0.01）。（三）CADPE促进乳腺癌细胞活性氧产生CADPE（0～80μmol/L）处理人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及

6、MDA-MB-435细胞48h，结果显示CADPE能明显增加细胞内活性氧（ROS）产生。（四）CADPE降低乳腺癌细胞线粒体膜电位JC-1法测定线粒体膜电位，结果显示CADPE处理后乳腺癌细胞的线粒体膜电位明显降低。II（五）CADPE对乳腺癌细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2表达的影响Westernblot检测结果显示CADPE处理后乳腺癌细胞Caspase-3和Bax表达上调，而Bcl-2表达下调。（六）CADPE抑制配体刺激的乳腺癌细胞VEGFR、EGFR及C-Met磷酸化MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞分别经相应配体刺

7、激后，VEGFR、EGFR、Src、C-Met磷酸化增加，而预先使用CADPE处理组，VEGFR、EGFR和C-Met磷酸化水平相对未处理组增幅较小，但CADPE对Src磷酸化水平无明显影响。（七）CADPE影响乳腺癌细胞EGFR磷酸化的时间及剂量依赖性MDA-MB-435细胞经EGF刺激后，EGFR磷酸化水平增高，这种作用随CADPE孵育时间延长或者CADPE浓度增加而降低。（八）CADPE抑制乳腺癌细胞Her-2、c-myc及maz蛋白表达CADPE处理乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞后，可以降低Her-2、c-myc及ma

8、z蛋白表达。（九）CADPE对裸鼠体内乳腺癌细胞瘤生长的影响裸鼠接种乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞成瘤后，给予CAD