ⅰ-ⅳ型登革病毒非结构蛋白ns1通用型单克隆抗体的制备及ns1抗原检测elisa方法的建立

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1、中画刘《獻硕ｉ研究生学位论文纖北京协和医学院研究生院学校代码１０：０２３学号：Ｓ２０１２０１８０１６硕±学位论文－ＩＶＩ型登革病毒非结构蛋白ＮＳ１通用型单克隆抗体的制备及ＮＳ１抗原检测化ＩＳＡ方法的建立Ｐｒｏ加ｃｔｉｏｎｏｆＵｎｉｖｅｒｓａｌＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎ杜ｂｏｄｉｅｓｆｂｒｕｅ－ＤｅｎｇＳｅｒｏｔｙｐｅＩＩＶＶｉｒｕｓＮｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌＰｒｏｎｔｅｉｎＮＳｌ，ａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＮＳｌＡｎｔｉｇｅｎＣａｐｆ：ｕｒｅ

2、ＥＬＩＳ乂所院：医学生物学研究所姓名：李多指导教师；孙强明研究员导师小组：李埼涵研究员刘龙下研究员马绍辉主任技师学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：登革病毒检测试剂研制完成日期二〇—：五年五月目录摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ２前胃３一Ｉ－ＩＶＮＳ１第部分型登革病毒非结构蛋白通用单克隆抗体的制备８１实验材料８１１．免疫抗原和检测抗原８１．２主要试剂８１．３实验动物９１４主．要实验材料９．９１５主要实验仪器１．６主要溶液配方．

3、．．．１０２实验操作与方法１０２．１免疫抗原的选择和制备１０２．２免疫动物１１２．３小鼠免疫后经ＥＬＩＳＡ方法检测其血清效价：１１２１２．４制备饲养细胞２５１２．杂交瘤细胞的制备２６１３．单克隆细胞株的筛选．２７腹水的制备１３２８１３．腹水抗体的纯化．．２．９抗体蛋白浓度的检测１４２．１０间接免疫巧光检测抗体特异性１５２１１Ｗｅｓｔｅｒｎｔｓ１５．ｂｌｏ检测抗体特异性２１．口单克隆抗体稳定性的检测６３结果与分析１６３１１６

4、．免疫小鼠Ｗ及血清效价检测３．２杂交瘤细胞的制备和筛选１６３．３抗体的纯化１７３４免疫巧光法检测抗体１７．３．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓ检测抗体１７３．６杂交瘤细胞株稳定性研究１８１４職８二部分Ｉ－ＩＶ第型登革病毒ＮＳ１基因克隆、表达、纯化及鉴定２０１实验材料２０１１病毒与细胞２０．１．２２０菌株１３２．载体质粒０１４、２０．酶抗体化及试剂盒１５．主要的生物化学试剂２１１２１．６主要实验仪器１２１．７主要溶液配方２实验操作与方

5、法２２２－２２．１ＩＩＶ型登革病毒的获取２２１－ＩＶ２２．型登革病毒核酸的提取２ｃＤＮＡ２．３病毒的获取２－Ｓ１２３２．４ＩＩＶ登革病毒非结构蛋白Ｎ全基因的获取－ＮＳ－２．５ＩＩＶ型登革病毒１ＰＭＤ１９Ｔ载体的构建２４－ＮＳ２．６ｐＥＴ３０ａｌ表达载体的构建２６２－ＮＳ＊２８．７ＩＩＶ型登革病毒１重组蛋白诱导表达条件的优４＾．．．．－ＮＳ２ＩＩＶ１重组蛋白的表达及２．８登革病毒纯化９２９ＳＤＳ－ＰＡＧＥ３０．检现！１２．１ｂｌ１ＯＷｅｓｔｅｍｏｔｓ鉴定重组

6、蛋白３２－１．１１ＩＩＶ登革病毒重组蛋白ＮＳ１免疫原性的检测３３结果与分析３２３－．１ＩＩＶ型登革病毒ＮＳ１全基因的获取３２－－ＭＤ３２１ＩＶ１Ｔ载体的构建及鉴定．型登革病毒ＮＳ１Ｐ９３２－３－Ｔ．３ＩＩＶ型登革病毒ｐＥ３０ａＮＳｌ表达载体的构建及鉴定３３３４Ｉ－ＩＶ．型登革病毒ＮＳｌ重组蛋白诱导表达条件的优化３４３－４．５ＩＩＶ型登革病毒ＮＳ１重组蛋白的纯化及鉴定３－．６ＩＮＳ１重组３５３ＩＶ型登革病毒蛋白免疫原性的检测３６第Ｈ部分登革病毒ＮＳ１抗原ＥＬＩＳＡ检测方

7、法的建立３８１实验材料３８．１１实验试剂和材料３８１２主．要实验器材３８２实验操作与方法％２．１捕获抗体和检测抗体的选择３８。２．２确定最佳包板浓度、生物素检测抗体浓度Ｗ及亲和素抗体浓度３９２．３双抗夹也检测方法的建立３９２．４变异系数及稳定性的巧步检测３９２．５最低抗原检出下限的测定４０２．６特异性检测４０２７临床血清学检测４０．３结果分析４０３．１捕获抗体和检测抗体的选择４０＇＇专３．２确定最佳包板浓度和生物素检测抗体浓度及亲和素抗体

8、浓度４０３３、４２．双抗体夹屯检测方法的建立３４变．．４２．异系数及稳定性的初步检ｆ３．５最低抗原检测下限４３３．６ＥＬＩＳＡ４４检测方法的特异性３．７临床血清学检测４４４Ｗ４４论４５小Ｓ４７参考文献５１附录５２ｍＭ