orfv感染宿主细胞mirna差异表达分析及vir蛋白抗体制备与细胞定位观察

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1、分类号密级UDC单位编号10733甘肃农业大学硕士学位论文ORFV感染宿主细胞miRNA差异表达分析及VIR蛋白抗体制备与细胞定位观察DifferetialAnalysisofMicroRNAExpressionfromHostCellsInfectedwithOrfVirusandPreparationofAntibodyAgainstVIRProteinofOrfVirusandCellularLocalizationObservationofVIRProtein成伟伟指导教师姓名刘磊教授（甘肃农业大学兰州730070）张克山副研究员（兰州

2、兽医研究所兰州730046）学科专业名称预防兽医学研究方向兽医微生物学与免疫学论文答辩日期2015年5月28日学位授予日期2015年6月19日答辩委员会主席郑海学研究员评阅人蒲万霞研究员孙晓林教授2015年6月ClassificationNo.：Secrecylevel：UDC：Schoolcode：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeDifferetialAnalysisofMicroRNAExpressionfromHostCellsInfecte

3、dwithOrfVirusandPreparationofAntibodyAgainstVIRProteinofOrfVirusandCellularLocalizationObservationofVIRProteinPostgraduate:ChengWeiWeiAdvisor:ProfessorLiuLeiAssociateProfessorZhangKe-ShanSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:VeterinaryMicrobiologyandImmunologyS

4、ubmittedTime:June2015Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要羊传染性脓疱病毒(orfvirus，ORFV)引起的羊传染性脓疱（contagiousecthyma）俗称“羊口疮”是一种重要的人兽共患性传染病。羊口疮的爆发和流行不但造成了严重的经济损失而且威胁人们身体健康。microRNA是一类长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，主要作用于基因的转录后调控，在胚胎发育、细胞分化、细胞凋亡、造血功能和疾病发生等方面都具有重要的调控作用。ORFV的干扰素抗性基因（VIR

5、基因）是其主要的毒力因子，对于病毒的复制具有重要作用。该基因作为ORFV的保守性基因，具有抗干扰素的功能，编码感染早期的抗干扰素蛋白。本试验以感染与非感染ORFV的羊皮肤成纤维细胞（GSFs）为研究对象，运用Solexa高通量测序技术对ORFV与GSFs互作过程中的microRNA进行了探索与功能分析。结果表明，本实验成功构建了感染与非感染ORFV的GSFs细胞差异表达microRNA的表达谱，共获得显著上调microRNA共509个，显著下调microRNA共169个，另有差异不显著的microRNA共479个。microRNA靶基因GO富集

6、分析表明，在基因的分子功能显著富集的条目中感染组GSFs细胞与非感染组GSFs细胞microRNA的主要差异在于感染组microRNA主要在许多酶活性与核糖核苷酸的绑定活动中富集；在所处细胞位置显著富集条目中感染组共7个主要与细胞膜、裂解泡、液泡和溶酶体相关，而对照组只有2个主要与细胞膜相关；在参与的生物过程显著富集条目中感染组有2个主要与细胞脂质代谢过程相关，而感染组没有分析出显著富集的条目。通过microRNA靶基因KEGG通路显著性分析，并对感染组与非感染组富集的KEGG通路进行对比发现：在ORFV与GSFs细胞互作过程中，主要使micr

7、oRNA在细胞外基质受体互作途径、溶酶体、焦点粘连、白细胞迁移、Hedgehog信号通路、过氧化酶、胆汁分泌途径、激动蛋白细胞骨架调节通路和视黄醇代谢通路中发生了富集。为了进一步研究ORFV的VIR蛋白的生物学特性，本试验构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合的真核重组质粒pEGFP-VIR；免疫BALB/c小鼠制备了VIR蛋白的多克隆抗体。将质粒pEGFP-VIR转染绵羊睾丸细胞，观察了VIR蛋白在细胞内的表达分布情况。结果显示，表达和纯化了含有GST标签的GST-VIR蛋白，主要以可溶性形式存在，大小约27k

8、Da，制备的多克隆抗体效价达1∶218，WB显示抗体特异性较好，VIR蛋白主要分布于细胞核内。本试验通过分析感染与非感染ORFV的GSFs细胞差异表达