mir-let7a在辽宁绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定

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1、miR-let7a在辽宁绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定DifferentialExpressionofmiR-let7ainhairfolliclecycleofLiaoningCashmeregoatsandIdentificationofitstargets作者姓名：江倩专业名称：基础兽医学指导教师：张巧灵副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日中文摘要miR-let7a在辽宁绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定绒山羊是一类主要用于生产羊绒羊毛的山羊，目前

2、世界上主要的品种有伊拉克绒山羊、澳大利亚绒山羊、巴基斯坦披肩山羊、河西绒山羊以及辽宁绒山羊等。在我国有10种绒山羊被列为遗传资源保护品种，其中包括青藏高原山羊、辽宁绒山羊、吕梁黑山羊和内蒙古绒山羊等。为了提高我国羊绒的产量和质量，越来越多的具有优秀品质的绒山羊被选育出来，而毛囊是调控绒山羊被毛生长的重要组织，深入研究毛囊的周期发育调控机制对提高和改善羊绒品质有重要的作用。后基因组时代的到来，为研究毛囊周期发育开辟了新的道路。近年来，有关非编码小RNA的调控机制的研究逐渐成为热点问题。microRNA（

3、miRNA）是介导分子进行基因沉默的一类大家族非编码RNA，具有调节机体生长发育，细胞增殖分化，信号传导及免疫应答反应等多种功能。1993年首个miRNA（lin-4）被VictorAmbros和RosalindLee等在对秀丽线虫幼虫发育调控的研究中发现以后，越来越多的研究表明，miRNA在动物和植物中均有表达，并在动植物基础生命活动中发挥不同的作用。在动物中，let-7家族是研究最深入的miRNA之一，其主要编码let7a，let7b，let7c等12个基因，对细胞的增殖，分化及肿瘤的形成等方面起

4、重要的调控作用。近年来已有研究表明let-7家族可以调控皮肤黑色素瘤的形成并在山羊和绵羊的皮肤组织中均有表达，但有关其如何调控毛囊的周期发育研究很少。因此，本研究在前期高通量测序的基础上，选择差异表达miRNA-let7a为研究对象，对绒山羊毛囊发育周期的调控机制进行了系统的研究。首先利用荧光定量PCR技术检测了miRNA-let7a在绒山羊毛囊发育生长期和退行期的表达差异，然后利用生物信息学软件miRGenV3.0对miRNA-let7a的靶基因进行预测，并进一步通过DAVID6.7基因注释工具中的

5、GO和KEGG分析筛选出与毛囊发育周期相关的靶基因，随后通过荧光定量PCR和Western-blot技术分别在mRNA水平和蛋白水平对候选靶基因进行鉴定,并利用双荧光素酶报告基因检测法（Dualluciferasereportergeneassay）鉴定靶基因的作用靶点。由于细胞转染效I率的高低直接影响到后续实验结果，因此我们利用MTT，荧光显微镜观察法及流式细胞法对转染效率进行了优化。通过对miRNA-let7a在绒山羊毛囊发育周期中的研究，阐明miRNA-let7a及其靶基因在绒山羊毛囊发育周期中

6、的作用机理，为提高和改善绒山羊羊绒产量和品质提供了新的思路。具体研究结果如下：1.通过荧光定量PCR技术检测miRNA-let7a的表达,发现其在绒山羊毛囊发育的不同时期均有表达，且在退行期中的表达量显著高于生长期。2.利用在线生物学软件miRGenV3.0预测miRNA-let7a的靶基因，并通过DAVID6.7软件分析筛选出与毛囊发育周期相关的三个靶基因：Cmyc、FGF5和IGF-1R。利过生物信息学软件NCBIBlast对Cmyc、FGF5及IGF-1R进行同源性分析，结果显示三个靶基因与绵羊

7、、牛、马等其他物种的同源性高达90%以上。3.通过荧光定量PCR技术在mRNA水平上对候选靶基因Cmyc、FGF5及IGF-1R进行鉴定，结果显示三个候选靶基因在绒山羊生长期中表达量均高于退行期，进一步通过Western-blot技术在蛋白水平上对候选靶基因Cmyc和FGF5进行鉴定，结果表明候选靶基因Cmyc和FGF5在绒山羊生长期中表达量高于退行期，与荧光定量结果一致，并与miRNA-let7a表达趋势相反。这说明Cmyc和FGF5是miRNA-let7a的靶基因。4.利用噻唑蓝染色法（MTT）、

8、荧光显微镜观察法及流式细胞法对HEK-293T细胞转染效率进行检测。结果表明：每孔加入1μl脂质体，mimics与质粒载体共转染的最终浓度分别为100nM和0.8mg时，转染效率最高为53.13%，可以用于后续研究。5.利用双荧光素酶报告基因检测法鉴定miRNA-let7a与其靶基因Cmyc和FGF5的作用靶点。结果显示，靶基因Cmyc及FGF5与miRNA-let7a“种子序列”结合的靶位点分别为CTGCCTC和ACTCCAT。关键词：miRNA-le