enu诱变小眼畸形小鼠模型的分子机制研究

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1、山Ｖ：賴鏡嫂：名？，？－＞庐藏爹霧；蠢学号－＇覇心…，分类号、—．於，々、冰—．＾级ＵＤＣ＿■＿＿—、４、；ｐ．？＇．’‘．获：．策Ｖ分、读；换感叫义！ＷＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶｍｉＳＩＴＹ三安梦追譯六一＂‘－＂心－＾．？心硕壬学佐冷文净讀？．－＇＇ｙ＾？一＇？＊／、？尸，？■。＇一…■一＾■公一４会ｔ：产．（学术型），／＾ｊｃ＾％东黏：护角藻ＥＮＵ诱变小眼崎形小鼠模型的分子机制研究心，；＿七善＾‘．Ｒ、細Ｖ．八、論＇一．２２５００９薛餐风巧究员，江，１指导教师姓名，陆兵

2、副教授，扬州大学苏扬州．＿ｙ＇：‘＇＇：＼申请学位级别：硕去学科专业名称动物学．．＿耗０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月＿＜论文提交日期：２＇．．痴＇ｉ－－’■難扬＾１１大；２０１５年６月Ｃ学位授予单位：学学位授予日期＇＾授－：、逆省％答辩委员会主席：徐秀龙教＿：香祭海ｔ令公品５心月師着詔夺纖禮齡若、欲？Ｐ－＇冷会Ｖ之方．－＇－‘．。＊茶取一‘－．ｙ—＇一＝－．右＇？．＾（｜＊苗：＊＾尸—一学位论文ＥＮＵ诱变小眼崎形小鼠模型的分子机制研究Ｔｈｅ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅ

3、ｃｈａｎｉｓｍｏｆａｎＥＮＵＩｎ加ｃｅｄＭｏｕｓｅＭｉｃｒｏｈｔｈａｌｍｉａａｎｄａｎｏｈｔｈａｌｍｉａＭｏｄｅｌｐｐ研究生：耿滕导师：薛整风研究员Ｉ耿滕：ＥＮＵ诱变小暇畴巧小鼠模型的分子机制研究ＥＮＵ诱变小眼崎形小鼠模型的分子机制研究中文摘要出一Ｚｉ焼基亚硝基腺（目ｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ，ＥＮＵ）是种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ＥＮＵ能不依赖于任何代谢过程，而通过烧化反应将其乙烧基加入ＤＮＡ碱基的部分基团，从而引起碱基配对错误，在较短时间内诱导小鼠产生大量一。，该突随机突变表型

4、采用ＥＮＵ诱变手段，本实验室得种常染色体显性小眼晴形小鼠一一，该小变小鼠表现为侧或双側小眼崎形，且严重程度不鼠突变纯合子表现为出生时无：眼且很快死亡。本研究该突变系小鼠为研究对象，从抖下Ｈ个部分开展研究工作一１ＥＮＵ诱变获得例小眼小鼠一通过ＥＮＵ诱变，将其中例小眼崎，在Ｇ１代小鼠中筛查发现了小眼表型的小鼠形Ｃ５７ＢＬ化化６）雄性小鼠与正常Ｂ６雌鼠合笼，获得Ｂ６背景的杂合子小鼠，观察并记录１００只后代中，巧中２３只小鼠具有小眼表型。将Ｂ６背景杂合子小鼠与ＤＢＡ（Ｄ２）小鼠配种获得Ｆ１代小鼠，Ｆ１代小鼠回交Ｂ６得到Ｎ２代小鼠，记录的５６１只Ｎ２代小

5、鼠中有２。１只表现为小眼表型２小眼突变基因的定位及鉴定为了定位该突变基因，将（Ｂ６ｘＤ２）Ｆ１突变杂合子小鼠回交Ｂ６获得Ｎ２代小鼠，提取Ｎ２代小鼠的鼠尾ＤＮＡ，利用微卫星对突变小鼠的染色体进行全基因组扫描。定位一结果表明在４４个样品中突变基因与微卫星Ｄ１８ｍｉｔｌ２４与Ｄ１８ｍｉｔｌ８４之间未发生例交换，最终将突变基因定位于微卫星Ｄ１８ｍｉｔｌ２４与Ｄ１８ｍｉｔｌ８４之间。通过对局部区域基因功能分析４Ｚ。，初步判定化基因为本突变候选基因设计扩増针对化４乂基因编码区引物，对野生型及小眼小鼠ＤＮＡ进斤ＰＣＲ扩増。产物回收后进行测序比对，结果

6、湿示突变小鼠ｉ＾＾基因编码第５５９位碱处发生Ｃ到Ｔ的转换，导致编码区第１８７位密码子ＣＧＡ（编码精氨酸）变为终止密码子ＴＧＡ，引起蛋白编码提前终止。３Ｒ１８７Ｘ无义突变对ＲＡＸ蛋白功能影响分析－ＲＴ－ＰＣＲＭＤ１９Ｔ扩増野生型及突变纯合子小鼠化基因，将其克隆到Ｐ载体上，－－ＣＭＶ－ＣＭＶｔｏ２Ｂ然后再亚克隆到ｐｔａＢ真核表达载体，分别命名为ｐｗＲＡＸ、换ｇ－－－ｐＣＭＶｔａｇ２ＢｍＲＡＸ。用脂质体２０００将Ｗ上重组载体转染于ＣＯＳ７细胞，分别用于后续的间接免疫巧光、ＰＩ染色Ｗ及ＥＭＳＡ实验。间接免疫黃光及内染色结果显示正常及突ｎ扬州大

7、学硕壬学位论文变ＲＡＸ蛋白都定位于细胞核，故排除民１８巧突变对ＲＡＸ蛋白核定位的影响。ＥＭＳＡ实验结果显示Ｒ１８７Ｘ无义突变影响ＲＡＸ蛋白与相关ＤＮＡ序列结合，从而导致小鼠小眼表型。关键词：ＥＮＵ；小眼崎形；基因定位；化基因及蛋白；ＥＭＳＡ耿滕：ＥＮＵ诱变小暇時形小鼠模型的分子机制研究亞Ｔｈｅ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｎＥＮＵＩｎｄｕｃｅｄＭｏｕｓｅＭｉｃｒｏｈｔｈａｌｍｉａａｎｄａｎｏｈｔｈａｌｍｉａＭｏｄｅｌｐｐＡｂｓｔｒａｃｔ＂ＥＮＵｉｓｓｕｃ