enu诱变瞳孔散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究

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1、学位论文ENU诱变lI：j=L散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究TheMolecularMechanismandGeneticCharacteristicsofanENU．InducedDilatedPupilsMouseModel国家自然科学基金项1三I(31000987)扬州大学2012年5月陈兵：ENU诱变瞳孔散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究ENU诱变gt-孑L散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究煳黜研究生：陈兵导师：孙怀昌教授论文摘要乙烷亚硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)是一种能够引起基因高效突变的烷化剂，通过使用ENU

2、诱导小鼠突变的手段，经过筛选可获得大量具有突变表型的G1代小鼠，用于基因功能的研究及人类疾病动物模型的建立。通过ENU诱导小鼠突变，我们获得一种瞳孔散大小鼠，研究发现该突变表型是由Nrgl基因突变引起，药理及免疫组化实验表明该突变导致小鼠瞳孔括约肌上M受体减少。该小鼠被命名为Nrglm1y2锄(neuregulin1；mutation1,YangzhouUniversityComparativeMedicineCenter,hereafterOpl)。遗传实验表明突变杂合子小鼠瞳孔散大表型外显率极低，而纯合子小鼠外显率为100％。本研究工作分为以下五个

3、部分：lENU诱变获得一种瞳孔散大小鼠通过ENU诱导小鼠突变手段获得一种瞳孔部分散大杂合子小鼠，当用光线照射小鼠眼球时，该小鼠瞳孔对光线无明显反射现象(无明显收缩)。将瞳孔散大杂合子小鼠与正常B6小鼠配种后共观察并记录115只后代小鼠，其中3只小鼠出现单侧且部分瞳孔散大表型；将瞳孔散大杂合子互交，观察并记录34只后代，共有5只后代小鼠表现为瞳孔散大表型，其中1只小鼠表现为单侧且部分瞳孔散大表型，4只小鼠表现为双侧且严重瞳孔散大表型；4只双侧且严重瞳孔散大表型小鼠互交后代全部表现为瞳孔散大表型。II扬州大学博士学位论文2瞳孔散大突变基因的定位在初步染色体

4、定位过程中，采用B6背景瞳孔散大突变小鼠与C3H或D2小鼠配种获得的Fl代小鼠，并将F1代小鼠与B6背景野生型小鼠回交获得的N2代突变小鼠配种方案繁殖用于定位小鼠。定位结果发现在25个N2瞳孔散大小鼠样品中突变基因与微卫星D8mitl71(距着丝粒11．43cM)和D8mit4(距着丝粒18．89cM)均未发生交换，从而确定该突变基因位于小鼠第8号染色体D8mitl71和D8mit4之间(或附近)。另外突变基因与其他染色体上所选微卫星均无明显连锁。由于以上配种方案获得具有突变表型的N2代小鼠的外显率极低。在精确定位过程中改用将瞳孔散大突变小鼠与D2或C

5、3H小鼠配种得到F1代，再将F1代小鼠互交获得F2代突变小鼠方案进行定位。结果共获得118只F2代突变小鼠，最终将瞳孔散大突变基因定位于遗传标记rs32829041(单核苷酸多态性标记)与D8Mit4之间，两标记间距离约1．52Mb。在此区间目前已报道Dusp26，Rnfl22，BC019943，Makl6，Futl0，7420700N18Rik，Snordl3，Mirll86，Nrgl共9种基因，但无相关基因突变引起瞳孔散大异常表型的相关报道。3瞳孔散大突变基因的克隆与序列分析对上述9种基因分别进行测序分析。序列比对结果显示Dusp26、Mirll8

6、6、Rnfl22、Snordl3、BC019943、Makl6、Futl0、7420700N18砒k序列与数据库或本中心B6小鼠相应基因序列一致，基本排除这些基因的突变引起DpJ小鼠瞳孔散大表型的可能。在对Nrgl基因测序分析后发现在Nrgl外显子E59(该外显子编码NRGl蛋白EGFl3结构域)后第5个碱基处发生G到A的转换。由于瞳孔散大小鼠G到A的碱基突变位于mRNA剪接供体位点，推测该突变可能影响剪接体对该位点剪接能力，从而引起Dpl小鼠瞳孔散大表型。为了证实以上设想，设计分别扩增Ig及CRD型Nrgl局部序列的引物(扩增区域包含突变位点)。通过

7、RT-PCR方法，分别从瞳孔散大及野生型B6小鼠脑组织总RNA中扩增相应片段，RT-PCR产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示对瞳孔散大及野生型B6小鼠Ig及CRD型Nrgl基因分别扩增出3个条带(banda、bandb、陈兵：ENU诱变瞳孑L散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究IIIbandc)。其中bandb对应于131．typeEGFNr91，该类型Nrgl在大脑中高度表达。定量分析结果表明与野生型小鼠相比突变纯合子小鼠Nrgl的CRD及Ig型Nrgl中bandb基因表达量仅分别为野生型小鼠的42．6％和32．8％。对野生型B6和瞳孔散大

8、小鼠Ig型及CRD型条带a直接测序表明：野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型4种a条带测序