enu诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究

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1、学位论文ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究TheMolecularMechanismofanENU．．InducedHirschsprungMouseModel研究生：糜婷导师：薛整风研究员国家自然科学基金面上项目(31372269)国家自然科学基金青年基金项目(31000987)糜婷：ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究研究生：糜婷⋯一风嘲㈣燃中文摘要乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea，ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程，而通过烷化反应将其乙烷基加入DN

2、A碱基的部分基团，从而引起碱基配对错误。利用ENU可在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段，本实验室筛选获得了一种显性遗传的腹部白斑小鼠，该小鼠突变纯合子表现为严重花斑表型且出现巨结肠症。本研究以该突变系小鼠为研究对象，从以下3个部分开展研究工作：1ENU诱变获得一种巨结肠症小鼠通过ENU诱变C57BL／6(B6)雄性小鼠后将其与正常B6雌鼠合笼，在Gl代小鼠中筛查发现了一例腹部白斑表型的小鼠。将其与野生型B6d,鼠配种后记录的25只后代小鼠中，其中9例小鼠表现为腹部白斑表型。将该杂合子小鼠互交获得42只小鼠，其中12只为花斑表型的突变纯合子小鼠，进一步

3、研究发现突变纯合子小鼠表现为腹部肿大，并于出生后数周死亡。解剖发现，突变纯合子小鼠出现严重的巨结肠表型。2巨结肠突变基因的定位及鉴定为了定位该突变基因，将(B6×D2)F1突变杂合子小鼠互交获得F2代巨结肠小鼠，提取F2代小鼠的鼠尾DNA，利用微卫星对突变小鼠的染色体进行基因组扫描。定位结果表明在24个样品中突变基因与微卫星D14mitl65及D14mi265未发生一例交换；最终将突变基因定位于微卫星D14Mitl65与D4Mit265之间(或附近)，通过对局部区域基因功能分析，初步判定Ednrb基因为本突变候选基因。设计扩增针对Ednrb基因编码区引物，对野生型及巨结肠小鼠

4、脑总IⅢA进行RT-PCR扩增，产物回收后进行测序比对，结果显示B6d'鼠编码区第865位碱基为T，而巨结肠小鼠为C，该突变位于Ednrb基因第4号外显子。氨基酸序列预测表明，该突变引起EDNRB蛋白第286位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所替代(L286P)，突变发生在EDNRB蛋白第5跨膜区。3Ednrb(L286P)错义突变对细胞内Ca2+浓度的影晌扬州大学硕士学位论文扩增野生型及突变纯合子小鼠Ednrb基因，将其克隆至UpCMV-ta92B真核表达载体，分别命名为pCMV-ta92B．WETB、pCMV-ta92B．METB。用脂质体2000将以上重组载体转染于CHO．K

5、1细胞，同时设pCMV-ta92B空载体为对照组。转染24～48h左右加入Flu04．AM孵育30min后采用三个不同浓度ET．3刺激15min，最终通过多功能酶标仪检测细胞内荧光强度。结果发现：与转染pCMV-ta92B．WETB组相比，转染pCMV-ta92B．METB组细胞Ca2+浓度显著降低，进一步表明L286P突变可影响EDNRB蛋白功能，是引起巨结肠表型的主要原因。关键词：ENU；巨结肠症；基因定位：＆枷6基因：Ca2+浓度测定糜婷：ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究TheMolecularMechanismofanENU．．InducedHirschspru

6、ngMouseModelM．S．Candidate：MiTingSupervisor：Prof．ZhengfengXueAbstractIIIENUissuchamutagen．Thissyntheticcompoundwasdescribedasthe“mostpotentmutageninmice”．FollowinganENU—mutagenesisscreen，alargenumberofmousemutantswithavarietyofphenotypeswererecovered．WeheredescribeanENU—treatedB6malemouse，sh

7、owedaclusterofwhitespotsontheabdomen．Homozygousmutants，generatedbyintercrossoftheheterozygousmutants，showedextensivewhitespottingofthecoatandaganglionicmegacolon．Ourworkisdividedintothreepartsbasedonthemutantmice．1．GenerationofHirschsprungmiceusingENUmut