ca16疫苗候选株减毒特性及生产工艺的初步研究

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1、京输如皆聲供中＠聲３钟令獻硕±研究生学位论文北京协和医学院研究生院北京协和医学院硕±研究生论文学校代码：１００２３学号１：Ｓ２０１２０８０１７硕±学位论文ＣＡ１６疫苗候选株减奉特性及生产工艺的初步硏究所院：医学生物学研究所姓名：杨水芝指导教师：谢忠平导师小组：李华、龙涧乡学科专业：生物化学与分子生物学研巧方向；病原生物学完成日期：２０１许巧北京协和医学院硕±研巧生论文目录摘要３前胃７－口手足病及其流行概况７二手足口病病原学简介９ＨＣＡ１６

2、病毒分子生物学特征９四ＣＡ１６流行病学特征１１五ＣＡ１６疫苗及生产工艺研究现状１１六ＣＡ１６动物模型研巧进展１３毛本论文的研究思路、目的及意义１４实验材料与方法１５－实验材料１５１细胞１５２病胃１５３实验动物１５４主要试剂１５５实验耗材１６６实验仪器１６二实验方法１７１疫苗候选株减毒特性的研巧１７２生产工艺的初步探讨２３２７实验结果及分析－ＣＡ１６疫苗候选株减毒特性的研巧２７１ＣＡ１６疫苗候选株的筛选２７２毒株经低温连续

3、传代后生长特性的评价２８‘３毒株３３Ｃ连续传代后湿度特征分析２８’４毒株３３Ｃ连续传代后免疫原性及成鼠动物模型的评价２８‘５毒株３３Ｃ连续传代后致病性的研究３０６毒株遗传稳定性的检测巧７减毒株交叉保护效果的评价巧二生产工艺的初步探讨％１毒株稳定性影响因素及评价３５２不同纯化工艺的初步评价３７讨论４２４７全文小结１北京协和医学院硕±研巧生论文参考文献４７附录主要缩略词５２致谢５３研究生简历５４２北京协和医学院硕±研巧生论丈摘要口

4、一手足病（ｈａｎｄ仿ｏｔａｎｄｍｏｕｔｈ出ｓｅａｓｅＨＦＭＤ，，）是种在全球范围内流行的急，近几年来性传染病，其在亚太地区的爆发尤为严重。在我国，手足口病已成为危害婴幼儿健康的重要公共卫生问题。柯萨奇病毒组１型（ＣｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓＡ１６，ＣＡ１６）和７１（ＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓＡ６肠道病毒型７一１￡乂７。直Ｗ来，研巧人员把工作重点放在了致，〇是引起手足口病的主要病原体病率和致死率更高的ＥＶ７１上，而目前越来越多的研巧表明ＣＡ１６的感染也是导致一重症及死亡病例的重要因素之。但是目前

5、还没有针对ＣＡ１６引起的手足曰病的特１６效治疗方案和预防手段。疫苗是控制手足口病的关键，本研究对ＣＡ候选株减毒特性和生产工艺进行初步的研巧，旨在为其减毒疫苗的开发奠定基础。实验将两株ＣＡ１６高免疫原性的毒株经过连续低温传代减毒后，进巧减毒特性‘的评价，结果发现３３Ｃ连续低温传代后毒株表现出下特性（１）减毒候选株保持１１ＫＭ１５４稳定的生长特性，低温传至第代次后株的感染性滴度波动范围小于０５ＬＣＣＩＤｍＩ２．５〇／（）０．５ｍｌ／ｇ；减毒候选株具有良好的免疫原性，Ｗ病毒收获液只的１４１００剂量腹胺注射免疫成

6、鼠后抗体效价大于：为阳性，其抗体阳转率达％，从抗体几何平均滴度（ＧｅｎｏｍｅｔｒｉｃＭｅａｎＴｉｔｅｒ，ＧＭＴ）来看，最高可达１：３０；（３）减毒候选株的致病性研究中发现随着代次的升高减毒株对现鼠的致病力减弱，ＫＭ１５４毒株的第１２代次（ＫＰ１２）后感染的乳鼠未见发病及死亡情况，组织中能检测到ＣＡＩ６（４），病毒，但无明显的病理改变；减毒候选株基因序列检测结果发现与初始代次相化，毒株基本保持了遗传的稳定性；（５）交叉保护研究结果显示，候选株免－ＣＡ１疫兔后制成的兔抗１６血清对所选的４株ＣＡ１６毒株具有１

7、００％的保护作用，而ＥＶ７一１５株１株只有株受保护；（６）在感染了两个减毒候选株的ＩＣＲ成鼠（腹腔注射）及郭鼠（烦内注射）的脑、脾、肾、肺、肝、也、肌肉、脊髓组织中检测到ＣＡ１６病毒，表明病毒能在乳鼠及成鼠组织内复制并传播。本研究还对生产工艺进行了初步的探讨。（１）在毒株稳定性影响因素的研巧‘－１ＣＡ化中我们发现，０次Ｗ内的冻融次数对毒株的感染性滴度无影响７０Ｃ；毒株在与液氮中储存８个月后，两个条件下的毒株感染性滴度相同，均为６．５８ＬＣＣＩＤ５〇／ｍＬｇ与原始相比，基本没有下降；（２）加入ＭｇＣｋ和我所甲

8、肝无明胶的冻干保护剂后毒株的感染性滴度下降速率明显减缓，加入０．５ＭＭｇＣｂ组至第７天只下降了１．４ＬｇＣＣ圧＞５〇／ｍｌ。（３）不同纯化工艺的探讨中我们发现氯仿抽提对病毒的感染性滴度及抗原含量回收率都较