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时间:2019-03-12
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1、铝胁迫下大豆NADP-ME基因表达及与柠檬酸分泌的关系TheexpressionofsoybeanNADP-MEgeneanditsrelationshipwithcitrateeffluxunderaluminumstress作者姓名:徐跃滋专业名称:植物营养学研究方向:植物营养生理生化及分子生物学指导教师:尤江峰教授学位类别:农学硕士答辩日期:2015年6月7日中文摘要铝胁迫下大豆GmNADP-ME基因表达及与柠檬酸分泌的关系全球有40%的可耕地土壤为酸性。在酸性土壤上,Al毒被普遍认为是限制作物产量及植物生长的主要因
2、素。铝诱导大豆根系柠檬酸是大豆最重要的抗铝机制。根据前期转录组实验分析发现,GmNADP-ME基因在铝胁迫下转录表达上调,结合其生物信息学分析,本研究欲针对GmNADP-ME基因进行功能解析,并重点阐明其在铝诱导大豆根系柠檬酸分泌中的作用。具体方法和结果如下:以耐铝大豆品种吉育70为实验材料,利用反转录(reverse-transcription,RT)PCR的方法,以铝处理后的大豆根尖cDNA为模板,扩增得到NADP-ME的开放阅读框(openreadingframe,ORF)全长1769bp(GenebankNO),通
3、过序列比对及进化树分析,发现GmNADP-ME与菜豆、拟南芥等NADP-ME基因序列相近,亚细胞定位分析表明GmNADP-ME蛋白定位非专一性,可能位于胞质、叶绿体等亚器官,符合其他NADP-ME蛋白的特征。利用实时定量(Quantitativerealtime,qRT)PCR技术,研究在铝胁迫不同时间后GmNADP-ME基因的转录表达情况,发现该基因在铝处理4h后开始迅速升高,且表达量达到最高值,随处理时间的延长其表达量逐渐减少。利用In-Fusion克隆技术将GmNADP-ME构建到植物表达载体pCAMBIA3301上
4、,得到融合表达载体后,以发根农杆菌K599介导的方法对大豆上胚轴进行侵染,利用luminometer酶标仪进行LUC荧光鉴定,得到含GmNADP-ME基因的阳性大豆发根。利用苏木精染色法检测根尖铝的累积,并通过酶法测定植物在Al胁迫下的柠檬酸分泌的速度,最终发现,与大豆主根(非转因)及空载(发根)进行比较,过表达GmNADP-ME大豆发根根尖铝的累积量少,且能分泌更多的柠檬酸。通过以上研究,说明GmNADP-ME是大豆根尖响应铝处理早期的一个基因,结合其生物学功能,推测GmNADP-ME可能通过为三羧酸循环提供碳骨架,从而
5、促进柠檬酸在细胞内的累积,提高铝胁迫下柠檬酸的分泌,最终提高增强了大豆的耐铝性。关键词:酸性土壤,大豆,铝毒,发根转化,GmNADP-MEIAbstractTheexpressionofsoybeanNADP-MEgeneanditsrelationshipwithcitrateeffluxunderaluminumstress40%ofthearablelandonearthistheacidicsoil.Altoxicityisconsideredtobethemainpointthatlimitsplantgrowt
6、handcropyieldonacidsoil.Forsoybean,AlinducedrootsecretionofcitricacidisthemostimportantmechanismtoresistAltoxicity.WefoundthatGmNADP-MEgenecanup-regulationinresistancetoaluminumstressaccordingtothepreliminarytranscriptomeexperiments.inthisstudy,inordertoanalysisfu
7、nctionofGmNADP-ME,wecombinedwithbioinformaticsanalysisandfocusontherootsecretioncitricacidinducedAltoxicityinthesoybean.Themainmethodsandresultsareasfollows:choosingresistanceofAltoxicitysoybeanvarietyjiyu70asexperimentalmaterials,usingreversetranscription(reverse
8、-transcription,RT)aluminumtreatedsoybeanrootscDNAastemplate,amplifiedtheopenreadingframeofNADP-ME(openreadingframe,ORF).thefulllengthwas1769bp,Bysequenc
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