铝胁迫下大豆nadp-me基因表达及与柠檬酸分泌的关系

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1、铝胁迫下大豆NADP-ME基因表达及与柠檬酸分泌的关系TheexpressionofsoybeanNADP-MEgeneanditsrelationshipwithcitrateeffluxunderaluminumstress作者姓名：徐跃滋专业名称：植物营养学研究方向：植物营养生理生化及分子生物学指导教师：尤江峰教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月7日中文摘要铝胁迫下大豆GmNADP-ME基因表达及与柠檬酸分泌的关系全球有40%的可耕地土壤为酸性。在酸性土壤上，Al毒被普遍认为是限制作物产量及植物生长的主要因

2、素。铝诱导大豆根系柠檬酸是大豆最重要的抗铝机制。根据前期转录组实验分析发现，GmNADP-ME基因在铝胁迫下转录表达上调，结合其生物信息学分析，本研究欲针对GmNADP-ME基因进行功能解析，并重点阐明其在铝诱导大豆根系柠檬酸分泌中的作用。具体方法和结果如下：以耐铝大豆品种吉育70为实验材料，利用反转录（reverse-transcription,RT）PCR的方法，以铝处理后的大豆根尖cDNA为模板，扩增得到NADP-ME的开放阅读框(openreadingframe，ORF)全长1769bp（GenebankNO），通

3、过序列比对及进化树分析，发现GmNADP-ME与菜豆、拟南芥等NADP-ME基因序列相近，亚细胞定位分析表明GmNADP-ME蛋白定位非专一性，可能位于胞质、叶绿体等亚器官，符合其他NADP-ME蛋白的特征。利用实时定量（Quantitativerealtime,qRT）PCR技术，研究在铝胁迫不同时间后GmNADP-ME基因的转录表达情况，发现该基因在铝处理4h后开始迅速升高，且表达量达到最高值，随处理时间的延长其表达量逐渐减少。利用In-Fusion克隆技术将GmNADP-ME构建到植物表达载体pCAMBIA3301上

4、，得到融合表达载体后，以发根农杆菌K599介导的方法对大豆上胚轴进行侵染，利用luminometer酶标仪进行LUC荧光鉴定，得到含GmNADP-ME基因的阳性大豆发根。利用苏木精染色法检测根尖铝的累积，并通过酶法测定植物在Al胁迫下的柠檬酸分泌的速度，最终发现，与大豆主根（非转因）及空载（发根）进行比较，过表达GmNADP-ME大豆发根根尖铝的累积量少，且能分泌更多的柠檬酸。通过以上研究，说明GmNADP-ME是大豆根尖响应铝处理早期的一个基因，结合其生物学功能，推测GmNADP-ME可能通过为三羧酸循环提供碳骨架，从而

5、促进柠檬酸在细胞内的累积，提高铝胁迫下柠檬酸的分泌，最终提高增强了大豆的耐铝性。关键词：酸性土壤，大豆，铝毒，发根转化，GmNADP-MEIAbstractTheexpressionofsoybeanNADP-MEgeneanditsrelationshipwithcitrateeffluxunderaluminumstress40%ofthearablelandonearthistheacidicsoil.Altoxicityisconsideredtobethemainpointthatlimitsplantgrowt

6、handcropyieldonacidsoil.Forsoybean,AlinducedrootsecretionofcitricacidisthemostimportantmechanismtoresistAltoxicity.WefoundthatGmNADP-MEgenecanup-regulationinresistancetoaluminumstressaccordingtothepreliminarytranscriptomeexperiments.inthisstudy,inordertoanalysisfu

7、nctionofGmNADP-ME,wecombinedwithbioinformaticsanalysisandfocusontherootsecretioncitricacidinducedAltoxicityinthesoybean.Themainmethodsandresultsareasfollows:choosingresistanceofAltoxicitysoybeanvarietyjiyu70asexperimentalmaterials,usingreversetranscription(reverse

8、-transcription,RT)aluminumtreatedsoybeanrootscDNAastemplate,amplifiedtheopenreadingframeofNADP-ME(openreadingframe,ORF).thefulllengthwas1769bp,Bysequenc