联合转染hhcn1和hhcn4基因改良生物起搏模型的基础研究

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1、君例乂爭Ｉ博±学位论文Ｉ＂＂．－７Ｈ：！？！ＷＨｉｔｘｉｉｓ联合转染ｈＨＣＮｌ和ｈＨＣＮ４基因改良生物ｍ的細研究起搏模型硏究生姓名钱晓东指导獅齡杨向军＾１专业名称内科学＾１研究方向心血管病学＾１？＝＾＾ｚ■１苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行硏究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或者撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作

2、出重耍贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明。本人承担本声明的法伟责任。论文作者签名—：日期：ＩＸ〇苏州大学学位论文使用授权声明、本人完全了解苏扑１大学关于收集保存和使用学位论文的规定，目Ｐ：学位论文著作极归厲苏州大学。本学问论文电子文档的内容和纸一质论文的内容相致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中松、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子、文档，可缩印或者其他复制手，允许论文被查阅和借阅Ｗ采巧影印段保存和汇编学位论文，可切将学位论文的

3、全部或部分内容编入宵关数据库进行检索。涉密论文〇本学问论文属在年月解密后适用本规定。／非涉密论文囚４＇－论文作者签名：叛邸Ｈ期〇ｏ巧（Ｔ０如导师签名：日期：２。一０＾之口联合转染hHCN1和hHCN4基因改良生物起搏模型的基础研究中文摘要联合转染hHCN1和hHCN4基因改良生物起搏模型的基础研究中文摘要第一部分：乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞的提取及其电生理特点的比较目的：对乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞进行分离培养，膜片钳记录乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞起搏电流(If)和动作电位并比较其特点，运用实时定量聚合酶链式反应(PCR)分

4、析乳鼠心室肌If基因的表达。方法：通过酶消化法分离乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞，其中窦房结组织取自界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部，心室肌细胞取自乳鼠心室。用光镜、膜片钳记录动作电位等方法鉴定窦房结细胞和心肌细胞；用全细胞膜片钳技术记录乳鼠窦房结细胞和乳鼠心肌细胞的If并研究其特性;采用实时定量PCR技术检测乳鼠窦房结细胞和乳鼠心室肌细胞If基因即超极化激活的环核苷酸门控通道(mHCN)亚型1、2和4的表达。结果：(1)通过酶消化法分离乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞，用光镜、膜片钳记录动作电位等方法鉴定；(2)培养3~5天，光镜下可观察到搏动更快的梭形细胞，膜片钳记录动作电位频率

5、为174.4±14.6bpm(n=20)，证实为窦房结细胞。观察到自发搏动频率较慢的多角形细胞，膜片钳记录动作电位频率为69.7±10.1bpm(n=20)，证实为心室肌细胞。全细胞膜片钳记录到乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞的If，并分别得到电流-时间曲线，窦房结细胞If电流的半最大激活电位约为-77.74mV，而乳鼠心室肌细胞If电流的半最大激活电位-93.58mV，窦房结细胞自律性显著高于乳鼠心室肌细胞。实时定量PCR检测，乳鼠窦房结细胞的mHCN1：mHCN2：mHCN4为(4.16±0.19)：(0.03±0.19):1，以mHCN4和mHCN1为主；乳鼠心室肌细胞的

6、mHCN2：mHCN4为(4.62±0.23):1，未检测到mHCN1表达。结论：乳鼠窦房结细胞和心室肌细胞均有超极化激活的If电流，二者均表达HCN基因，窦房结细胞的自律性显著高于乳鼠心室肌细胞，窦房结细胞主要表达mHCN4和I中文摘要联合转染hHCN1和hHCN4基因改良生物起搏模型的基础研究mHCN1，心室肌细胞主要表达mHCN2和mHCN4，二者表达HCN基因亚型的差异可能是影响其自律性的重要因素之一。第二部分：慢病毒介导hHCN4转染骨髓间充质干细胞构建生物起搏模型目的：研究超极化激活环核苷酸门控阳离子通道基因亚型4（hHCN4）转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSC

7、s），与乳鼠心肌细胞共培养构建心脏生物起搏器模型的可行性。方法：构建包含hHCN4基因和绿色荧光蛋白的穿梭质粒pCDH-GFP-hHCN4，并通过四质粒系统包装成慢病毒颗粒LentiV-GFP-hHCN4，转染大鼠的MSCs，构建成+hHCN4MSCs；将仅有GFP基因的慢病毒颗粒LentiV-GFP的MSCs设为对照组-hHCN4MSCs。通过荧光显微镜、RT-PCR以及Western-blot观察鉴定hHCN4基因在MSCs中的表达；Puro筛选转染了hHCN4基因的MSC，获得稳定表达hHCN4的MSCs细胞株，膜片钳记