经鼻腔移植缺氧预处理的骨髓间充质干细胞对于小鼠脑出血作用的研究

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1、导师单位：首都医科大学附属北京友谊医院完成日期：二○一五年五月首都医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日首都医科大学博士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………2英文摘要…

2、…………………………………………………………………4前言（引言、序言）………………………………………………………7正文（包括材料、方法、结果、讨论、结论等部分）第一部分：脑出血模型的建立……………………………………………7第二部分：缺氧预处理骨髓间充质干细胞………………………………17第三部分：经鼻腔移植缺氧预处理骨髓间充质干细胞…………………29第四部分：经鼻腔移植缺氧预处理骨髓间充质干细胞对于小鼠脑出血神经功能作用的影响及机制的研究……………………41结论…………………………………………………………

3、………………51文献综述……………………………………………………………………58参考文献……………………………………………………………………63附录…………………………………………………………………………71攻读学位期间发表文章情况………………………………………………72致谢…………………………………………………………………………73个人简历……………………………………………………………………741首都医科大学博士学位论文中文摘要研究背景脑出血占全部脑卒中的10%-15%，具有很高的死亡率及致残率，对患

4、者、家庭及社会均可造成极大的负面影响和经济负担。目前，尚没有美国FDA批准的用于治疗脑出血的有效药物。近年来，干细胞移植已经成为治疗多种神经系统疾病的临床研究热点，用于脑出血的治疗亦逐渐受到研究者的关注。骨髓间充质干细胞（Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）是目前研究最多的一种干细胞。BMSCs具有向三个胚层分化的潜能，可自体取材移植，不需要组织配型、无免疫排斥等诸多问题，同时因其致癌性较低、来源丰富、培养条件相对简单等优势而成为研究热点。但是，对于治疗不同的疾病，

5、如何选择适宜的BMSCs移植途径、剂量和时间，以及治疗的远期效果等问题还在不断的研究探索中。研究目的通过在体和离体实验，探讨经鼻腔途径移植缺氧预处理的骨髓间充质干细胞对小鼠脑出血的治疗作用及相关机制。实验方法实验共分为4个部分。1．建立小鼠脑出血模型：用不同剂量的胶原酶IV立体定向注射至小鼠脑基底节区，采用病理解剖及行为学方法检测脑出血模型成功与否。2．缺氧预处理BMSCs：取原代培养BMSCs，置入氧气浓度为0.5%的容器中24小时，应用MTT法检测缺氧预处理后的细胞活性，划痕试验检测细胞的迁移能力，

6、Westernblot技术检测相关血管及神经生长因子的表达。3．检测经鼻腔途径移植的HP-BMSCs：经鼻腔途径给予HP-BMSCs，荧光显微镜下沿嗅球、大脑皮层、血肿周围寻找荧光标记的HP-BMSCs，验证该方法的可靠性。4．应用神经行为学、免疫组化及免疫印记等技术验证HP-BMSCs移植治疗效果：实验动物随机分为假手术组，对照组及治疗组。全部实验小鼠在建模前均进行行为学训练。（1）神经行为学检测方法包括mNss、Rotarod、贴纸去除实验以及旷场试验，分别检测不同时间点经鼻腔移植HP-BMSCs对

7、于小鼠行为学的变化；（2）采用Westernblot技术检测血肿灶周围神经生长因子，包括血管内皮生长因子（VasclarEndothelialGrowthFactor，VEGF）、脑源性神经生长因子（Brain-DerivedNerotrophicFactor，BDNF）和胶质细胞源2首都医科大学博士学位论文性神经生长因子（Glialcellline-DerivedNeurotrophicFactor，GDNF）的表达情况；（3）应用免疫组织化学技术检测侧脑室下区（SubventriclarZone，S

8、VZ）神经母细胞迁移和血肿灶周围新生神经元情况；（4）以Nissl染色技术评估小鼠脑出血后的病理改变。实验结果1．以0.03U胶原酶IV立体定向注射至小鼠基底节区，脑出血模型稳定，神经功能缺损症状明显，死亡率低。2．经缺氧预处理的BMSCs细胞活性及迁移能力明显增强，与对照组相比，BMSCs的促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO），促红细胞生成素受体（Erythropoietin，receptor，EPOR）基质细胞衍生因子