经典和高致病性prrsv疫苗株嵌合病毒的构建及免疫原性分析

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1、分类号：Q959.4单位代码：10193密级：公开学号：2012660硕士学位论文经典和高致病性PRRSV疫苗株嵌合病毒的构建及免疫原性分析ConstructionandImmunogenicAnalysisofChimericVirusesbetweenAttenuatedClassicalandHighlyPathogenicPRRSVVaccineStrains作者姓名：张武超学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物传染病及其病原分子流行病学指导教师：蔡雪辉研究员所在学院：动物

2、科学科技学院提交日期：2015年4月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1

3、、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的

4、论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是一种由PRRS病毒（PRRSvirus,PRRSV）引起的猪病毒性传染病，主要临床特征为妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪呼吸系统疾病。国内于1996年首次分离到PRRSV，2006年由PRRSV变异株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合症（HP-PRRS）给我国养猪

5、业造成了巨大的经济损失，已成为严重危害我国养猪业的传染病之一。目前，疫苗免疫仍是防控PRRS的有效方法，但现有的经典和高致病性PRRSV疫苗在诱导机体免疫反应和交叉保护等方面存在差异，而关于这种差异产生的分子基础尚无报道。因此，本实验选择经典和高致病PRRSV疫苗株为研究对象，以期通过构建嵌合病毒揭示PRRSV疫苗株产生这种免疫学反应差异的原因或基因区域，同时为PRRSV基因组结构与功能的研究提供新方法和思路。本实验在HP-PRRSVHuN4-F112疫苗株的全长cDNA分子感染性克隆pHuN4

6、-F112基础上，利用反向遗传操作技术，将pHuN4-F112基因序列分别替换为经典PRRSVCH-1R疫苗株的相应基因，最终构建CH-1R株的全长cDNA分子感染性克隆，并将CH-1R基因组第454位的C沉默突变为T产生1个SpeI酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记。将含CH-1R株基因组全长cDNA质粒线性化后体外转录合成病毒RNA，转染BHK-21细胞包装病毒粒子，24h后将细胞液上清接种MARC-145细胞，拯救出病毒。通过细胞病变(CPE)观察、间接免疫荧光（IFA）和检测分子标记证明

7、病毒拯救成功。进一步比较拯救病毒与亲本病毒的病毒滴度、增殖动力学曲线，发现两者的病毒学及生物学特性没有显著差异，以上结果表明PRRSVCH-1R疫苗株感染性克隆构建成功。本实验以经典PRRSV疫苗株CH-1R的全长感染性克隆pCH-1R为骨架，利用反向遗传操作技术分别将其ORF1a、ORF1b和ORF2-7替换为HP-PRRSVHuN4-F112的相应片段，构建3个全长cDNA嵌合质粒。将构建的3个重组cDNA质粒经体外转录后转染BHK-21细胞，并于MARC-145细胞中传代，拯救出嵌合病毒，

8、分别命名为rCH-1R-T1a、rCH-1R-T1b和rCH-1R-T27。病毒一步生长曲线结果表明，3种嵌合病毒在MARC-145细胞中的生长特性与亲本病毒rCH-1R基本一致；嵌合病毒接种PRRSV阴性仔猪结果显示，嵌合病毒试验组血清中PRRSVN蛋白抗体阳转率分别为3/3(rCH-1R-T1a)、2/3(rCH-1R-T1b)和1/3(rCH-1R-T27)，而rCH-1R免疫组血清N蛋白抗体检测始终为阴性。以上结果表明，PRRSVORF1a和ORF1b区域在病毒诱导N蛋白抗体产生中起关键