prrsv+hn25株orf5基因的克隆和重组腺病毒的构建

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1、万方数据畜牧与兽医2010年第42卷第1期·61·PRRSVHN25株ORF5基因的克隆和重组腺病毒的构建于新友1，沈志强1如，管宇2，南松剑2，王金良2，肖跃强2，唐娜2(1．山东省畜禽用蜂胶疫苗工程技术研究中心，山东滨州256600；2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600)摘要：克隆PRRSVHN25株ORF5基因，测序并进行序列分析。结果显示ORF5基因编码区长603bp。编码200个氨基酸，与国内外VR-2332株、LV株和CH—la株ORF5基因的核酸序列同源性分别为99．O％，63．8％和

2、91．4％，而推导的氨基酸序列同源性分别为98．0％，58．8％和90．5％。构建含ORF5基因的重组腺病毒穿梭质粒，Pmel酶切线性化后，转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy一1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞，同源重组后筛选重组腺病毒质粒，经Pad酶切后转染293A细胞进行包装，获得重组腺病毒。通过PCR鉴定重组腺病毒含有ORF5基因，Westernblot检测的结果表明PRRSVORF5基因在293A细胞内获得表达。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；ORF5基因；重组腺病毒中图分类号：S852．6文献标识码：

3、A文章编号：0529-5130(2010)01．0061．03猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是上世纪80年代末出现的一种具有高度传染性的传染病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，据报道美国每年因该病所造成的经济损失可达5．6亿美元⋯。目前，该病在我国各省市均有不同程度的发生，有些地区相当严重，严重制约我国养猪业的发展。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)属于套式病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属口J，病毒的基因组为单股正链RNA，约1

4、5kb，包括8个开放阅读框架(ORF)，其顺序依次为：5’．ORFla—ORFlb-ORF(2-6)．ORF7．3’，病毒基因组的每个读码框都和相邻的读码框有部分重叠。其中ORF5编码糖基化的囊膜(E)蛋白，有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体旧o。腺病毒是在动物细胞中高效表达外源基因的常用工具，El区缺失的复制缺陷型腺病毒由于不能在非许可性细胞中增殖，故不会造成病毒在自然界中的扩散，因而作为基因工程疫苗载体具有较好的安全性，所以这类载体的应用日益广泛H』。本试验从PRRSVHN25株中扩增ORF5基因

5、，测序后与GenBank上的ORF5基因进行序列比较，构建遗传进化树，分析PRRSV流行毒株的遗传变异程度，为防治PRRS提供科学依据，并构建了表达PRRSVORF5基因的重组腺病毒，为PRRSV重组腺病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。收稿日期：2009-04—06；修回日期：2009．09．11基金项目：山东省自然科学基金项目(Y2006D26)。作者简介：于新友(1983．)，男，硕士。+通讯作者。l材料与方法1．1细胞、毒株、菌株和质粒Marc一145细胞、293A细胞、PRRSVHN25株、大肠杆菌DH5

6、0t、含有AdEasy-1的大肠杆菌BJ5183、穿梭载体pShuttle—CMV株均为本实验室保存；pMDl8一TVector为TaKaRa公司产品。1．2工具酶和试剂RNA提取试剂Trizol购自上海生工；AMV反转录酶、RNasin、dNTP、T4DNALigase、BglⅡ、SaZI、TaqDNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自大连宝生物公司；PmeI，PacI等限制性内切酶购自NEB公司；转染试剂Lipo-feetamine2000购自Invitrogen公司；HRP标记的山羊抗猪I

7、gG、HRP标记的山羊抗鼠IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司；猪抗PRRSV阳性血清本实验室保存。1．3引物的设计与合成参照GenBank中登录的PRRSVORF5基因序列，使用引物设计软件PrimerPremier5．0设计引物，并送上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：ORF5．F：5’一AGATCCCACCATGGTGGAGAAA-3’(船fⅡ)；ORF5一R：5’一GTCGACCTAAGGACGACCCCATrG一3’(SalI)。1．4PRRSVHN25ORF5基因的克隆用PRRSVHN25株

8、感染Marc．145细胞，当细胞病变达80％时，收取感染细胞培养物，反复冻融3次，离心，取上清，应用Trizol按常规方法提取组织总RNA做模板，Oligo(dT)12-18为引物进行反转录，然后以cDNA为模板进行PCR反应。ORF5基因扩增时的反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性万方数据AnimalHusbandry＆VeterinaryMedicine201