欧洲型prrsv重组腺病毒疫苗的构建效果评价

《欧洲型prrsv重组腺病毒疫苗的构建效果评价》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建效果评价　　猪繁殖与呼吸综合征(porcine　reproductive　andrespiratory　syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine　reproductive　and　respiratory　syndrome　Virus，PRRSV)引起的猪繁殖与呼吸系统疾病。目前该病在全球范围广泛流行，严重影响养猪业的健康发展。目前根据PRRSV基因型和抗原性差异可分为2个基因型，分别是欧洲型(基因Ⅰ型，代表株为LV株)和美洲型(基因Ⅱ型，代表株为VR-233

2、2)。一直以来，我国主要流行株为美洲型及其变异株，但如今欧洲型PRRSV的流行已经打破了地域的限制，近年来相继在福建，香港、内蒙古等地分离到欧洲型PRRSV。而该病曾在欧洲大规模流行，对养猪业造成严重损失，因此对欧洲型PRRSV的预防显得愈加重要。目前防控欧洲型PRRSV感染的商品化疫苗仅有灭活疫苗，但其免疫效果不十分理想，只能提供部分保护，不能预防感染。因此凾待研发一种新型有效的疫苗。　　腺病毒载体在基因治疗和疫苗生产中显示了较好的应用前景，其具有宿主范围广，病毒滴度高，可插入较大的外源基因片段且不整合到宿主基因组等特点

3、，是一种应用广泛的基因治疗载体。本研究以欧洲PRRSV　LV株ORF3、ORF5基因为对象，以人腺病毒五型为载体，构建重组腺病毒，并通过小鼠试验评价其免疫原性。　　材料与方法　　1　材料　　1.1　基因、质粒及细胞株　　PRRSV　LV株ORF3、ORF5基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成;人腺病毒五型野毒(Adenovirus　5公司;转染试剂X-treme　GENE　HP购自瑞士Roche公司;DMEM及胎牛血清购自美国HyClone公司;胶回收试剂盒和基因组DNA提取试剂盒购自美国Axygen　Biosciences

4、公司;其它试剂均为国产分析纯。　　2　方法　　2.1　引物设计　　根据PRRSV　LV株ORF3、ORF5基因组序列，应用Prime　5.0设计6条引物，其中引物ORF3-R(D-18TVector(于孵育器中16℃连接过夜)，构建克隆质粒18T-EU-ORF3、18T--EU-ORF5和18T-EUORF3-ORF5并转化至DH5α，而后小提质粒并测序。　　2.3　穿梭质粒的构建　　将构建的18T-EU-ORF3、18T-EU-ORF5和18T-EU-ORF3-ORF5分别与穿梭质粒pacad5K-N　pa以

5、BamHⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/NotⅠ、BamHⅠ/NotⅠ进行双酶切，然后在T4DNA连接酶作用下连接、转化，小提质粒后酶切验证。　　2.4　质粒的共转染　　将构建的腺病毒穿梭质粒与骨架质粒用PacⅠ酶切线性化后，以2μg质粒与2μl　Xtreme　GENE　DNA转染试剂、200μl　OPTI-MEM混匀后共转染至80%的HEK　293单层细胞中，1h后补加10%DMEM，于37℃、5%CO2温箱中培养，收集出现细胞病变(CPE)的HEK　293细胞。　　2.5　重组腺病毒GP3、GP5、GP3-G

6、P5目的蛋白I-2640调整细胞浓度为2106个/ml，于96孔细胞培养板每孔加50μl淋巴细胞(含1105个淋巴细胞)，并分别加入50μl　Con　A、50μl(1MOI)PRRSV灭活病毒及50μl　RPMI-1640作为非特异性刺激组、特异性刺激组与不加刺激物的对照组，同时设定空白对照组。于37℃、5%CO2培养箱培养72h，每孔加入10μl(5mg/ml)蛋白是主要结构蛋白，而GP5蛋白含有丰富的糖蛋白，可诱导机体产生中和抗体。同时GP3、GP4、GP5、M蛋白存在潜在的T细胞表位。这

7、对诱导产生有效的PRRSV抗体极为重要。基于此因素，为预防PRRSV的感染，人们致力于亚单位疫苗的研发。Chia等报道重组杆状病毒表达的GP3-GP5蛋白可对妊娠母猪提供68%的保护率。Jiang等以腺病毒为载体共表达的GP3-GP5，GP4-GP5，GP3-GP4-GP5免疫小鼠，结果均可刺激机体产生较高水平的抗体，但仅限于小鼠免疫实验。而以重组鸡痘病毒为载体，共表达IL-18-ORF5-ORF3，无论是中和抗体还是淋巴细胞增殖试验，均显示出较好的免疫原性。　　腺病毒已经被广泛研究60余年，人们也了解和掌握了它的许多生物

8、学特性，而以复制缺陷型腺病毒为载体的重组疫苗在细胞内均能高水平表达所连接的目的基因。正因如此，临床试验中腺病毒载体作为一种常用载体系统被用于递送外源基因。大多数腺病毒载体缺失E1区，由于E1区的缺失，使得载体在细胞系内不能复制。研究表明E1区缺失的腺病毒载体更适用于体内外的瞬时转染。E2蛋白介导病毒DN