疥螨丝切蛋白基因的原核表达、蛋白定位以及间接elisa诊断方法的初步建立

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1、ｇ？：ｊ分类号Ｓ８５２．７４＋６学号Ｓ２０１３６３Ｉ２四川巧业大学专业硕±学位论文巧峨丝切至白基因的原核表达、蚕白定位议及间接ＥＬＩＳ乂诊断方法的初步建立、郑宇指导教师杨光友教授，／校外导师房春林研究员（单位）Ｖ＼学位类别兽医硕壬领域名称动物寄牛．虫病学研巧方向分子寄生虫病学年２０１５年６月论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研巧工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人

2、或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢．ｎｂｃ．，琶、〇研究生签名；关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大挙有关保留：学校有权保留并向、使用学位论文的规定，即国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不

3、保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＂＂）（请在上□内划Ｖ＾研巧生签名：采阿＞／Ｊ年备月曰■导师签名：＾年备月＾＾摘要一巧瞒病作为种重要的人兽共患寄生虫病，严重影响人类健康和生活质量，，另外还能危害多种动物特别是在人口密度较大的区域内流行广泛，给社会经济，带来不可小觀的损失。目前该病己引起了世界许多国家和组织机构的重视针对巧曠的分子学研究不断深入，但还没有有效的免疫学诊断方法和疫苗问世。本研究根据ＮＣＢＩ数据库中巧蝴丝切蛋白基因的ＥＳＴ序列设计引物，通过扩增、克隆后获得４４７ｂｐ大小的目的基

4、因片段，将测序结果在ＧｅｎＢａｍｋ数据库一中比对后发现与己报道的尘瞒主要变应原之的Ｄｅｒｆ３１基因（ＧｅｎＢａ址：ＫＭ０１００１４．１）的序列相似性最高（９０％）。根据软件预测该丝切蛋白分子量约＝ＣＮ为１６．８ｋＤａ，等电点为ｐｌ５．巧，推导化学式为？５化９ｉ〇２３ｉＳｓ，蛋白带负电ｉ７５ｉ一，，荷，无信号肤切割位点不存在跨膜结构域是种膜外蛋白。将目的基因片段连入表达载体ｐＥＴ３２ａ（＋）后转入表达菌大肠杆菌￡．ｃＷ／ＢＬ２１（ＤＥ３），并Ｎｉ－亲和层析柱纯优化诱导条件，通过聚丙帰凝胶电泳验证该蛋白表达后，利用化巧蜡

5、丝切蛋白。在免疫印迹实验中，济蜡丝切蛋白重组蛋白与兔巧瞒阳性血，说明其具有良好的抗原性清反应后产生免疫印迹条带。利用纯化后的巧蜡丝一切重组蛋白免疫制备疫苗免疫实验兔，将采集到的高免血清作为抗用于巧光组织化学实验，，结果发现该蛋白广泛分布于巧瞒虫体组织中但表皮中未检测到该蛋白存在。经过条件优化筛选和特异性，、重复性试验将纯化后的丝切重组蛋白作抗原，成功建立了间接ＥＬＩＳＡ检测方法。实验结果确定抗原最佳包被浓度为５腿／ｍＬ，０二３０００山－血清的最佳工作浓度为１：１０，酶标抗最适使用浓度为１：。利用Ｃ〇任计－４５０．１．１

6、８８算公式确定阴阳性临界值，最后得到ｃｕｔ０任值为０８８，即当血清ＯＤ（ｆｅ．，．判为阳性，反之为阴性７９％敏感性８３巧％。另。再根据公式计算出特异性８外该方法检测出，该重姐蛋白与患痒瞒的和患豆状囊尾哟Ｉ的兔阳性血清均不发生？？１．２８４．０８％之１．８１５．３０交叉反应％间，批间变异系数为％％；批内变异系数在之间。。本试验证明巧瞒丝切重组蛋白具有潜在的诊断价值关键词：巧魄；丝切蛋白；蛋白定位；ＥＬＩＳＡＩＣｌｏｎｉｎｇ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｍｍｉｍｏｌｏｃａｌｉｚａ村ｏｎｏｆＣＯ打ｌｉ

7、ｎｅｎｅｆｒｏｍＸｆｌｆｃｓ知ｅ／ａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｎｇｗｋ－ｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬｌＳＡＺｈｅｎｇＹｕ（Ｖｅ化ｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ）ＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙｐｒｏｆｅｓｓｏｒＹａｎｇＧｕａｎｇｙｏｕ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，ＣｏＵｅ呂ｅｏｆＶｅ１：ｅｒｉ打ａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＣｈｅｎｇＭｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ，６１１１３０）Ａｂｓｔｒａｃｔ’Ｓａｒｃｏｐｔｅｓｓｃａｂｉｅｉ、ａ

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