猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及间接elisa检测方法的建立与初步应用

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1、分类号至堕!壑UDC．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．——硕士学位论文猪胞内劳森氏菌抗原候选蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与初步应用刘磊学科专业亟随盏医堂指导教师黄住坚数援论文答辩日期2Q13：Q5：28学位授予日期兰21圣：翌笸：墨旦答辩委员会主席矍廷苤数援广西大学学位论文原创性和使用授权声明fUlIIIHIIHFJIIIIJHIIIUlY2408277本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的

2、地方外，论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编

3、学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。f叼不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：复』磊指导教师签名：蕉伟坚作者联系电话：i弓q77／f2Czf日期：2夕，弓．夕∥，乡日期功I洋多冉“ciP．电子邮箱：踮易Sf2f7国住c例猪胞内劳森氏茵抗原候选蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立与初步应用摘要本研究以胞内劳森氏菌阳性猪回肠粘膜DNA为模板，通过PCR和Nested—PCR的方法扩增出胞内劳森氏菌四个抗原候选蛋白(即外膜蛋白OMPl022、外膜蛋白OMP0902、

4、外膜蛋白OMPl024和表面脂蛋白SLP0235)的基因序列，并分别构建T-A克隆质粒，再亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中得到原核表达质粒pET32a—OMPl022、pET32a—OMP0902、pET32a—OMPl024和pET32a—SLP0235，酶切鉴定及序列测定表明，重组表达质粒构建正确。将原核表达质粒pET32a—OMPl022、pET32a—OMP0902、pET32a—OMPl024和pET32a—SLP0235转入宿主表达菌BL一21(DE3)中，IPTG诱导表达，重

5、组蛋白1022和0902获得表达，而重组蛋白1024和0235未表达或表达量过低。分两段扩增OMPl024，得到1024a和1024b，并构建得到原核表达质粒pET32a—OMPl024a和pET32a—OMPl024b，转入宿主表达菌BL一21(DE3)V0，经IPTG诱导后均得到表达。Western—blot证实重组蛋白1022、0902、1024a和1024b均有较好的抗原性。重组蛋白1022为可溶性表达，其余以包涵体的形式得到表达。Ni2+亲和层析法进行纯化获得纯化蛋白。Western—bl

6、ot验证纯化复性后重组蛋白的抗原性，结果显示均具有良好的抗原性，其中重组蛋白1024b的抗原性最强。以纯化后的重组蛋白1024b作为包被抗原建立间接ELISA检测方法，优化后确定最佳反应条件为：抗原包被浓度为O．5pg／mL，37。C包被2h；血清稀释40倍，37℃反应1h；二抗稀释8000倍，37℃反应30min；TMB底物室温显色10min。用优化好的ELISA反应条件检测20份阴性血清，确定阴阳性临界值为O．321。血清吸附试验、交叉反应试验和竞争性抑制试验证明LI一1024b间接ELISA具

7、有很好的特异性。利用建立好的LI一1024b间接ELISA检测采白广西部分地区不同年龄段猪群的648份临床血清，有436份为阳性，总阳性率为67．3％。其中南宁、柳州、桂林、贵港和玉林地区猪群的阳性率分别为52．7％、81．1％、76．5％、68．O％和71．8％。哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪和公猪的阳性率分别为50％、30．8％、61．9％、92．4％和88．6％。关键词：猪增生性肠炎胞内劳森氏菌抗原候选蛋白原核表达间接ELISA血清学调查PROKARYOTICEXPRESS10NTHECAND

8、IDATEANTIGENPROTEINOFPORCINELAWSSONIAINTRACELLULARIS，ESTABLISHMENTOFANINDERECTELISAFORDETECTIONOFANTIBODYAGAINSTLAWSONIAINTRACELLULAIUSANDTHEPRELIMINARYAPPLICATION．ABSTI认CTWehavesuccessfullyamplifiedthegenesequencesoffourcandidateantige