应用组织透明化技术实现全眼球组织成像的初步探索

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1、温州医科大学硕士学位论文分类号：R77单位代码：10343学号：1102020047硕士学位论文论文题目:应用组织透明化技术实现全眼球组织成像的初步探索研究生姓名：叶贝学科专业：眼科学类型：专业型指导教师：俞阿勇二O一八年五月1温州医科大学硕士学位论文论文题目:应用组织透明化技术实现全眼球组织成像的初步探索答辩委员会主席：颜建华（中山大学）答辩委员会成员：陈世豪（温州医科大学）李瑾（温州医科大学）论文答辩日期：2018年05月20日2温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要.....................

2、.........................4英文摘要..............................................6缩略语................................................9前言.................................................10材料与方法...........................................13结果........................

3、.........................18讨论.................................................24结论.................................................27参考文献.............................................28致谢.................................................31综述...................

4、..............................32学位论文独创性声明...................................46关于学位论文使用授权声明.............................463温州医科大学硕士学位论文应用组织透明化技术实现全眼球组织成像的初步探索中文摘要目的：拟用组织透明化技术，对正常小鼠的胚胎眼与成熟眼球行器官水平的三维成像，观察胚胎及成熟眼球中标记物的表达和分布情况，探讨该技术在全眼球组织成像中的应用价值，在一定程度上为全眼球器官水平的三维

5、（three-dimensional，3D）成像奠定基础。方法：以BALB/c白化小鼠作为动物模型，选取3月龄雄性或雌性小鼠的眼球及小鼠孕14天时的胚胎作为研究对象。用冰1×PBS（phosphate-bufferedsaline）溶液、新鲜冰水凝胶单体溶液先后对麻醉后的小鼠进行心脏灌注；取新鲜的眼球及胚胎标本置于新鲜冰水凝胶单体溶液中在4℃条件下固定24小时；固定结束，对眼球和胚胎标本进行水凝胶组织包埋透明化处理；透明化结束后，对眼球及胚胎标本进行免疫荧光染色，对眼球标本尝试采用视网膜和晶状体的标记物进行荧光

6、染色，分别为GFAP（Anti-GlialFibrillaryAcidicProteinAntibody,cloneGA5）、αβ-crystallin，浓度各自为1：50,孵育时长均为72小时；对胚胎标本尝试采用视网膜和血管的标记物进行荧光染色，分别为Rhodopsin、Lectin，浓度各自设置为1：50,孵育时长均为72小时，一抗孵育结束，加入羊抗鼠IgG（ImmunoglobulinG）抗体，第二抗体的孵育浓度均为1:200，孵育时长均为48小时；眼球与胚胎标本均在第二抗体振洗结束后加入DAPI（4′,

7、6-diamidino-2-phenylindole）对细胞核进行染色，孵育24小时，PBST（PhosphateBufferedSalineTween-20）溶液振洗24小时；免疫荧光染色结束后，将眼球和胚胎标本加入到匹配组织折光系数的折光系数匹配溶液（refractiveindexmatchingsolution，RIMS）中24小时；组织折光系数匹配结束后，将标本放在特制的模具中在激光扫描共聚焦显微镜下进行观察与成像，并保留最终的免疫荧光图片。结果：1.经透明化处理后的标本3月龄眼球标本中，透明化时长为3

8、天、4天、5天的标本变透明。14天胚胎标本中，透明化时长3天、4天的标本变透明。4温州医科大学硕士学位论文2.免疫荧光染色的结果在14天胚胎（透明化时长为5天）中标记的Rhodopsin和Lectin这两种抗体在激光共聚焦显微镜下均获得较好的阳性结果。其中抗体Rhodopsin在胚胎眼的视网膜部位有检测到明显的荧光信号表达，包括组织的浅层及深层水平，同时获得了抗体分布的三维立体图，其成