固定化粘红酵母细胞制备l-苯丙氨酸的研究

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1、成都理工大学硕士学位论文固定化粘红酵母细胞制备L-苯丙氨酸的研究姓名：李铭申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：杨建元;钟辉20080501摘要固定化粘红酵母细胞制备L一苯丙氨酸的研究作者简介：李铭，男，1981年9月生，师从成都理工大学钟辉教授，2008年06月毕业于成都理工大学化学工艺专业，获得工学硕士学位。L一苯丙氨酸(L—Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人和动物必需的氨基酸之一。其主要用于功能性食品添加剂阿斯巴甜的生产。目前，由于国内氨基酸大输液和抗癌药的开发利用，特别是对糖精生产实行限制，阿斯巴甜需求量激增

2、，LPhe的市场需求也相应增加。本文利用固定化粘红酵母细胞，以苯丙氨酸解氨酶(PAL)／肉桂酸途径制备L—Phe。并对固定化条件、固定化细胞部分酶活性质、效应因子和戊二醛化学修饰对固定化细胞酶活的影响、酶反应条件以及固定化细胞批式反应制备L—Phe进行了研究。由本实验室不同时期保存的10株粘红酵母菌出发，经过初筛和复筛，选出高PAL酶活性的肋odotor以a耵utjnjs．06l12—8—3菌株，作为本实验的供试菌。分别以琼脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、海藻酸钙作为粘红酵母细胞固定化的载体材料，通过对固定化后酶活回收率、载体机械强度

3、等因素进行考察，最终确定聚丙烯酰胺作为本实验固定化细胞的载体材料。对固定化过程中的单体浓度、交联剂浓度、包埋浓度、包埋时间进行了单因素考察，以单因素实验结果为参考，用响应面法对固定化条件进行了优化。首先，用Plackett—BurⅢan法设计实验对以上四个影响因素进行了评价，并筛选出显著影响因素——单体浓度和包埋浓度，第2步用最陡爬坡实验逼近以上两因素最优水平。最后由中心复合实验及响应面分析确定主要影响因素的最佳条件。固定化粘红酵母细胞的最优包埋条件为：单体浓度：16．7％；包埋浓度：43％；交联剂浓度：2．O％；包埋时间：45

4、min。在此条件下得到的固定化细胞酶活保留率可达63％，较优化前提高了31％。考察了固定化细胞的部分酶学性质，并与游离细胞进行了对比。在热稳定性方面，固定化细胞与游离细胞基本一致，40℃保温时酶活较稳定，60℃保温条件下，酶活迅速丧失。对比反应时程曲线发现，固定化细胞的最大反应速率出现在4hr～8hr之间，较游离细胞出现了延滞。固定化后的细胞酶活稳定性明显增强，连续进行5个批次转化反应后仍保持一定的催化活性，而游离细胞第二次使用时酶活已经显著降低。成都理【：人学硕+学位论文固定化细胞中添加效应因子——山梨醇(a=18：1)，使用

5、O．05％的戊二醛溶液后处理固定化细胞都可使固定化细胞酶活提高。二者联合使用使固定化细胞的酶活保留率和酶活稳定性大大提高。通过对固定化细胞酶反应条件的优化，确定最优的酶反应条件：pH为11的底物转化液体反应混合物中，NH。+浓度3．0mol／l，底物肉桂酸的浓度为139／1，反应温度为30℃。初步研究了固定化细胞半连续批式转化肉桂酸制备L—Phe。固定化细胞经过10个批次的转化反应，大约有4．789的肉桂酸在O．1L的半连续批式生物反应器中被固定了209湿细胞(收获自1L摇瓶液体培养物)的固定化细胞生物转化，积累生成了5．339

6、的L—Phe；相当于在液体反应混合物中L—Phe的积累浓度达到了53．39／l。这与该菌株的中试整细胞一次批式转化工艺水平30g／l比较，产率提高了1．8倍。生物转化参数再进行进一步工艺优化，本非粮途径的酶法制L-Phe仍有工业开发价值。关键词：L一苯丙氨酸固定化细胞粘红酵母响应面分析法非粮途径儿Absn∞tstudyonproductionofL-PhebyimmobilizedcellsofIntroductionoftheautllor：LiMing，male，wasbominSeptember，l981．Mytlltor

7、waSProfessorZhongHui．Igraduated丘omChengduUnivers时ofTechn0109yinchemicaltecllIlologym勾or吼dwasgraJ吡edmeMasterDegrceinJunc，2008．AbstractL—phenylal枷nc(L—Phe)isa啪m“c锄inoacidofphysiologicalactivi吼a11disoneofessemia王眦i110acidfbrhumanbeingandanimal．itismainlyusedforproducing

8、fhnctionalfoodadditiveaspar乜me．Atpresem，duetothedevelopment锄dutilizationofanti—cancerdmgandmixed锄inoacidtms向siondomestic；廿lclim“ati