松材线虫3条效应因子基因克隆

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1、学校代码：10225学号：S18714学位论文松材线虫3条效应因子基因克隆零雅茗董爱荣副教授东北林业大学指导教师姓名：王峰副教授东北林业大学申请学位类别：硕士专业领域：森林保护学论文提交日期：2018年4月论文答辩日期：2018年5月授予学位单位：东北林业大学授予学位日期：2018年6月答辩委员会主席：论文评阅人：UniversityCode：10225RegisterCode：S18714DissertationfortheDegreeofMasterTheCloningof3BursaphelenchusxylophilusEffectorGenesCandidate:YamingLin

2、gSupervisor:AirongDongAssociateProfessorAssociateSupervisor:FengWangAssociateProfessorAcademicDegreeAppliedfor:MasterSpeciality:ScienceofForestryProtectionDateofOralExamination:May,2018University:NortheastForestryUniversity摘要摘要松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)传入我国已有三十多年，由松材线虫引起的松树萎蔫病（PineWiltDisease,

3、PWD）严重破坏我国森林生态系统，造成了不可估量的损失。至今仍未找到有效防治松材线虫的方法，松材线虫新的疫区仍在不断增加，且各种证据表明疫区有由气候温暖的南方逐渐向寒冷的北方扩散的趋势，最北已达到辽宁省大连市等地。松材线虫难以防治与其发病特点相关，病害发生初期没有明显的特征不易被发现，且其病害传播、病情发展极为迅速，当出现明显症状时疫情已经难以控制。松材线虫在与寄主植物互作过程中，通过产生效应因子破坏寄主防御系统，并在寄主体内快速繁殖蔓延直至寄主死亡。因此，通过对与致病性相关的松材线虫效应因子进行研究，为揭示松材线虫的致病机理提供理论依据。虽然早已完成基因组测序，但由于寄生策略与其他植物线虫

4、不同，松材线虫仅找到少量效应因子的同源基因。本试验通过提取接种松树后回收的松材线虫总RNA，构建了15个转录组文库，对其进行测序并分析差异表达基因，再经共表达及GO富集分析筛选出松材线虫候选效应因子并对其中3条候选效应因子基因进行功能分析及验证。试验所用线虫是由东北林业大学森林保护系线虫&菌物实验室提供的松材线虫虫株Bx2044和拟松材线虫虫株Bm0617，及中国林业科学院提供的松材线虫虫株Bx1022。为探究这3个线虫虫株的致病性强弱，选取黑松（Pinus.thunbergii）、马尾松（P.massoniana）及樟子松（P.sylvestrisvar.mongolica）作为寄主进行接

5、种试验。将Bx1022、Bx2044和Bm0617分别接种于黑松、马尾松及樟子松，计算感病指数并对线虫在寄主体内繁殖量进行分析。结果表明其中Bx1022对黑松、马尾松和樟子松致病性最强且黑松对其最为感病，接种1d与23d是产生大量的效应因子的两个时间点，而黑松和马尾松对松材线虫较为感病且互作关系明显，因此选取Bx1022接种黑松和马尾松后1d与23d这里两个时间点回收线虫并提取线虫总RNA为接种组，以无菌水浸泡2h的Bx1022的总RNA作为CK组进行转录组测序。通过对接种组和CK组转录组的基因表达量比较，从15个转录组中总共检测到17747个基因表达，根据差异显著表达分析（t-text，n

6、=3）结果，其中Pm-Bx1022-1d中有10852个基因差异表达不显著，6895个基因差异表达显著；Pm-Bx1022-23d中有9522个基因差异表达不显著，有8225个基因差异表达显著；Pt-Bx1022-1d中有10924个基因基因差异表达不显著，有6823个基因差异表达显著；Pt-Bx1022-23d中有8273个基因差异表达不显著，9474个基因基因差异表达显著。经共表达分析结果显示共1357个基因在两种树种两个时间点表现出共性，其中606条基因2树种2个时间点表达量均显著上调，751条基因表达量均显著下调。GO富集分析及跨膜结构域分析选取Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef

7、9为松材线虫候选效应因子，并进行基因克隆及功能分析。--I摘要为进一步验证候选效应因子，对Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9进行基因克隆后由原位杂交试验及RNAi试验进行基因功能分析。原位杂交试验结果显示，Bx-Ef1、Bx-Ef3和Bx-Ef9基因在均在松材线虫食道腺上表达。线虫效应因子分泌部位在食道腺、性腺和侧尾腺等器官上，其中食道腺为主要分泌器官，因此原位杂交试验结果表明该3个候选效应因子分泌部位